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甲基化修饰多肽
       也叫甲基化标记多肽，甲基化修饰是在其他常见的翻译后修饰（PTMs）中生物和物理化学特性方面非常突出的一种修饰手段。几乎参与细胞所有的生命活动过程，发挥着重要的调控作用，蛋白质在甲基转移酶的催化下将甲基转移至特定的氨基酸残基上共价结合的过程。甲基化是一种可逆的修饰过程，由去甲基化酶催化去甲基化作用。可以发生在20个常见氨基酸残基中的至少9个（Met, Cys, Lys, Arg, His, Gln, Asn, Glu and Asp）氨基酸中，而最常见甲基化/去甲基化主要发生在赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）侧链上，几乎参与生物所有的生命活动过程，如调节细胞功能，如转录、细胞分裂和细胞分化。甲基化修饰能够发生在不同的氨基酸位点，或是在同一个氨基酸位点产生不止一个甲基化修饰。
       研究发现，常见甲基化／去甲基化作用的氨基酸主要是赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）研究表明，组蛋白赖氨酸甲基化修饰执行着多种生物学功能，如干细胞的维持和分化、Ｘ染色体失活、转录调节和ＤＮＡ损伤反应等，主要是影响染色质浓缩，抑制基因表达。组蛋白精氨酸甲基化在基因转录调控中发挥着重要作用，并能影响细胞的多种生理过程，包括DNA修复、信号转导、细胞发育及癌症发生等因此专肽生物特地开发甲基化修饰多肽技术，为科学家在蛋白质翻译后修饰（PTMS）的研究中提供帮助。

甲基化修饰(Me1，Me2，Me3)

       采用高品质的Fmoc-Lys(Me,Boc)-OH、 Fmoc-Lys(Me2)-OH、Fmoc-Lys(Me3)-OH.HCL、Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OH 、Fmoc-Arg(me)2-OH.HCl(asymmetrical) 、Fmoc-Arg(me)2-OH.HCl(symmetrical) 等原料，采用Fmoc固相合成工艺合成，得到Lys甲基化，Arg甲基化标记的多肽，使用HPLC 对产物进行纯化。最终产品提供相应的质谱图，纯度分析的HPLC 色谱图。
 

多肽H2N-Ala-Arg-Thr-Lys(Me)3-Gln-Thr-Ala-Arg-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly-Lys-Ala-COOH的合成步骤：

1、合成CTC树脂：称取2.02g CTC Resin（如初始取代度约为0.54mmol/g）和1.31mmol Fmoc-Ala-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入3.27mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到  Fmoc-Ala-CTC Resin。结构图如下：

2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Ala-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取3.27mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入6.54mmol DIPEA，3.11mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

H2N-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

Fmoc-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

H2N-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

H2N-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

H2N-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

Fmoc-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

H2N-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

H2N-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

H2N-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

Fmoc-Lys(Me)3-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

H2N-Lys(Me)3-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Lys(Me)3-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

H2N-Thr(tBu)-Lys(Me)3-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Lys(Me)3-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Lys(Me)3-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

Fmoc-Ala-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Lys(Me)3-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Ala-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Lys(Me)3-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Ala-CTC Resin，结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-Ala-Arg-Thr-Lys(Me)3-Gln-Thr-Ala-Arg-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly-Lys-Ala-COOH。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽等。

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