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CD44是一个公认的肿瘤干细胞膜表面标志物，参与肿瘤的启动，进展，转移等，靶向肿瘤干细胞一直都是肿瘤药物开发的重点，针对 CD44 的 A6 短肽（KPSSPPEE）增强了聚合物囊泡表柔比星（EPI）对人类多发性骨髓瘤（MM）的靶向能力和抗癌效果（Gu 等人，2019 年）

A6肽(乙酰基-KPSSPPEE-氨基)是一个由8个氨基酸构成的可靶向抑制uPA与uPAR及SuPAR结合的多肽；单独使用时即可明显抑制鼠乳腺癌的转移，对于雌激素受体阳性的乳腺癌，其联用他莫昔芬后表现出更显著的抗肿瘤转移作用。此外有临床Ⅱ期试验证实其在卵巢癌治疗中具有良好的安全性和疗效。

在研究中，我们报道了具有CD44特异性A6短肽（KPSSPPEE）功能化多聚体表阿霉素（A6-PS-EPI）的有效制剂对人多发性骨髓瘤的体内靶向性和抗肿瘤作用。我们通过A6短肽的修饰显著增强了CD44过度表达的多发性骨髓瘤细胞LP-1对PS-EPI的摄取和抗癌活性，同时A6-PS-EPI避免了靶向配体在纳米平台上的复杂修饰，制备的A6-PS-EPI能够被CD44+细胞有效内化。

A6短肽是一种尿激酶衍生物，由8个氨基酸构成短肽序列（KPSSPPEE），它对CD44具有特异识别能力和较强的结合能力。对于CD44过表达的癌细胞来说，A6短肽是一种有效的靶向基团。

A6是由丝氨酸蛋白酶(人尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)的生物活性连接肽结构域衍生而来的八个L-氨基酸肽（(Ac-KPSSPPEE-NH2)。既不与uPA受体(uPAR)结合，也不干扰uPA/uPA R结合。A6与CD44结合，抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移，调节CD44介导的细胞信号。

靶向多肽可以根据其功能和用途分为不同的类别。在PDC（多肽偶联药物）中，靶向多肽通常被分为细胞穿透肽和细胞靶向肽两大类。

细胞穿透肽：这类多肽能够跨越细胞膜，转运具有生物活性的大分子物质，如多肽、蛋白质、核酸等化学药物，使其顺利进入细胞。一些常见的细胞穿透肽包括Pep-1、Pentratin、PepFact14、Transportan等。

细胞靶向肽：这类多肽的作用主要是引导化学药物或生物活性分子与特定类型的细胞结合，以提高其靶向性和治疗效率。常见的细胞靶向肽包括PEGA、生长激素抑制素类似物、蛙皮素类似物、RGD肽类等。

多肽H2N-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-COOH的合成步骤：

1、合成CTC树脂：称取0.59g CTC Resin（如初始取代度约为0.95mmol/g）和0.67mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入1.68mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到  Fmoc-Glu(OtBu)-CTC Resin。结构图如下：

2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Glu(OtBu)-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取1.68mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入3.36mmol DIPEA，1.6mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC Resin

H2N-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC Resin

H2N-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC Resin

H2N-Ser(tBu)-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC Resin

H2N-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC Resin

H2N-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Lys(Boc)-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Pro-Pro-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-CTC Resin，结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-COOH。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%、TFA：H2O=97.5%：2.5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽

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