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胶质母细胞瘤是最常见的原发性内在脑肿瘤，即使在最佳治疗情况下也无法治愈。胶质母细胞瘤表现出细胞层次结构，其中自我更新的胶质瘤干细胞（GICs）位于顶端。为了发现新的GIC靶点，文章使用体内 噬菌体展示技术筛选选择性结合GICs的分子，这些分子可能适合靶向治疗。噬菌体展示利用大型、多样化的肽图谱库来识别其天然构象与分子的相互作用。文章通过静脉注射将噬菌体肽图谱库传递到胶质母细胞瘤异种移植体内 然后推导出GICs。结合在GICs上的噬菌体肽被分析其对应的蛋白质，并根据预后价值进行排序，确定VAV3（一种涉及肿瘤侵袭的Rho鸟嘌呤交换因子）和CD97（Rho上游的粘附G蛋白偶联受体，分化抗原标志物97）可能在GICs中富集。文章确认VAV3和CD97都优先表达于表达GIC标志物的肿瘤细胞。VAV3的表达与GICs中其下游介质Rac1（Ras相关的C3肉毒梭菌毒素底物1）的活性增加相关。此外，通过RNA干扰靶向VAV3减少了GICs的生长、迁移、侵袭和体内 癌症发生。由于CD97是一种细胞表面蛋白，CD97的选择富集了球体形成，这是自我更新的替代指标。在计算机模拟分析表明，VAV3和CD97在肿瘤中高表达，并且与生存率低和肿瘤分级高相关，并且与表皮生长因子受体突变更常见。最后，通过噬菌体展示技术发现的VAV3肽序列能够特异性地被GICs内化。这些结果展示了一种新的筛选方法，用于识别在肿瘤等级中优先激活的致癌途径，为开发胶质母细胞瘤疗法提供了一种新策略。

体内噬菌体展示技术鉴定出胶质母细胞瘤干细胞特异性肽序列。（a）体内噬菌体展示技术方法示意图。将新鲜分离的异种移植人胶质母细胞瘤细胞皮下植入 BALB/c-nu 小鼠的侧腹。携带肿瘤的小鼠通过尾静脉注射噬菌体文库。从肿瘤中纯化出胶质母细胞瘤干细胞，并分离和测序与之结合的噬菌体。（b）通过噬菌体展示获得的肽序列及其对应的基因通过 NCBI BLAST 搜索功能（blast.ncbi.nlm.nih.gov）确定。对 TCGA RNA 测序数据的分析表明，VAV3 是序列 SSQPFWS 最有可能的噬菌体靶点。根据 169 例有可用数据的患者肿瘤的平均表达量，对 TCGA RNA 测序数据中 73602 个组装的异构体转录本的对数尺度表达量进行排序。蛋白质 BLAST 分析得分最高的序列已标出。（c）通过蛋白质 BLAST 分析鉴定出的序列 SSQPFWS 所示靶点的平均归一化 RNA 测序读数（代表表达量）显示。两项分析均表明，VAV3 在患者胶质母细胞瘤中的表达明显高于任何其他潜在靶点。（d）具有显著预后意义的数据集数量指的是 Oncomine 内与相关基因具有统计学上显著预后生存关联的数据集数量（即基因表达增加与生存率显著降低相关）。随后在 Rembrandt 数据库中查询已识别的基因，以确定低表达与高表达的相应基因的中位生存期（以月为单位）以及统计学意义。

靶向多肽可以根据其功能和用途分为不同的类别。在PDC（多肽偶联药物）中，靶向多肽通常被分为细胞穿透肽和细胞靶向肽两大类。

细胞穿透肽：这类多肽能够跨越细胞膜，转运具有生物活性的大分子物质，如多肽、蛋白质、核酸等化学药物，使其顺利进入细胞。一些常见的细胞穿透肽包括Pep-1、Pentratin、PepFact14、Transportan等。

细胞靶向肽：这类多肽的作用主要是引导化学药物或生物活性分子与特定类型的细胞结合，以提高其靶向性和治疗效率。常见的细胞靶向肽包括PEGA、生长激素抑制素类似物、蛙皮素类似物、RGD肽类等。

多肽H2N-Ser-Ser-Gln-Pro-Phe-Trp-Ser-COOH的合成步骤：

1、合成CTC树脂：称取2.54g CTC Resin（如初始取代度约为0.51mmol/g）和1.55mmol Fmoc-Ser(tBu)-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入3.89mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到  Fmoc-Ser(tBu)-CTC Resin。结构图如下：

2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Ser(tBu)-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取3.89mmol Fmoc-Trp(Boc)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入7.77mmol DIPEA，3.69mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Trp(Boc)-Ser(tBu)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Trp(Boc)-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Phe-Trp(Boc)-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Pro-Phe-Trp(Boc)-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Pro-Phe-Trp(Boc)-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Gln(Trt)-Pro-Phe-Trp(Boc)-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Gln(Trt)-Pro-Phe-Trp(Boc)-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Pro-Phe-Trp(Boc)-Ser(tBu)-CTC Resin

H2N-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Pro-Phe-Trp(Boc)-Ser(tBu)-CTC Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Pro-Phe-Trp(Boc)-Ser(tBu)-CTC Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Pro-Phe-Trp(Boc)-Ser(tBu)-CTC Resin，结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-Ser-Ser-Gln-Pro-Phe-Trp-Ser-COOH。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%、TFA：H2O=97.5%：2.5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽

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