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肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤。癌细胞在细胞膜上表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖 - 3（GPC - 3）。GPC-3 也在黑色素瘤细胞中表达。因此，GPC-3可能是肿瘤成像或治疗的一个潜在靶点。这里采用蛋白质组学质谱法来鉴定靶向 GPC-3表达肿瘤的肽段。构建了一个表达 FLAG-GPC-3 融合蛋白的哺乳动物表达载体用于免疫沉淀。利用脂质体将载体转染入 HepG2（HepG2/FLAG-GPC-3）和 HEK 293 细胞中，并用遗传霉素筛选转染的细胞系。HepG2/FLAG-GPC-3 细胞用于免疫沉淀 FLAG-GPC-3 融合蛋白。通过质谱分析筛选出 7 个候选肽段（L1-L7）作为 GPC-3 靶向配体。具有 14 个氨基酸的 L5 肽段（Arg-Leu-AsnVal-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln）显示出对 GPC-3 表达肿瘤细胞的选择性结合，其缩短的 L5 肽段（L5-2）具有 7 个氨基酸（Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln）也表现出同样的特性。这些肽段配体作为靶向 GPC-3 表达肿瘤的靶向基团，在诊断和/或治疗方面具有潜在的应用价值。

靶向多肽可以根据其功能和用途分为不同的类别。在PDC（多肽偶联药物）中，靶向多肽通常被分为细胞穿透肽和细胞靶向肽两大类。

细胞穿透肽：这类多肽能够跨越细胞膜，转运具有生物活性的大分子物质，如多肽、蛋白质、核酸等化学药物，使其顺利进入细胞。一些常见的细胞穿透肽包括Pep-1、Pentratin、PepFact14、Transportan等。

细胞靶向肽：这类多肽的作用主要是引导化学药物或生物活性分子与特定类型的细胞结合，以提高其靶向性和治疗效率。常见的细胞靶向肽包括PEGA、生长激素抑制素类似物、蛙皮素类似物、RGD肽类等。

多肽H2N-Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln-COOH的合成步骤：

1、合成CTC树脂：称取2.46g CTC Resin（如初始取代度约为0.43mmol/g）和1.27mmol Fmoc-Gln(Trt)-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入3.17mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到  Fmoc-Gln(Trt)-CTC Resin。结构图如下：

2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Gln(Trt)-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取3.17mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入6.35mmol DIPEA，3.01mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

H2N-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

H2N-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

H2N-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

H2N-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

H2N-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

H2N-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

H2N-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Gly-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

H2N-Gly-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Val-Gly-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

H2N-Val-Gly-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Asn(Trt)-Val-Gly-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

H2N-Asn(Trt)-Val-Gly-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Leu-Asn(Trt)-Val-Gly-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

H2N-Leu-Asn(Trt)-Val-Gly-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Leu-Asn(Trt)-Val-Gly-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Arg(Pbf)-Leu-Asn(Trt)-Val-Gly-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Phe-Leu-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-CTC Resin，结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-Arg-Leu-Asn-Val-Gly-Gly-Thr-Tyr-Phe-Leu-Thr-Thr-Arg-Gln-COOH。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽等。

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