基于 eIF2B 的糖原合成酶激酶-3 (GSK-3) 底物。
编号：200665
CAS号：
单字母：H2N-RRAAEELDSRAG-pSer-PQL-OH
2B-(SP) TFA 是基于 eIF2B 的糖原合成酶激酶-3 (GSK-3) 底物。2B-(SP) TFA 容易被 GSK-3α 的 GSK-3β 磷酸化。
2B-(SP) TFA is a eIF2B-based substrate for glycogen synthase kinase-3 (GSK-3). 2B-(SP) TFA is readily phosphorylated by both the α and β isoforms of GSK-3[1].
磷酸肽
在生命过程中发挥重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Tyr、Ser，Thr，。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是单苄基磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的连接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用该方法合成磷酸化多肽也有缺点，特别是在合成多磷酸化多肽或氨基酸较长的多肽的时候，连接效率低，最后产品纯度很低，对于这种磷酸化多肽，我们考虑采用后磷酸化方法，其合成过程就是在多肽合成结束后，选择性脱去要标记的氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1% TFA/DCM条件下可以定量的脱除。
后磷酸化，采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体，连接到羟基上，随后在过氧酸下氧化生成磷酰基，完成反应。
目前，多肽的磷酸化修饰方法主要有两种：
（1）将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中；
（2）多肽序列在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化。
1）将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中：
即事先将需要磷酸化的氨基酸（Thr,Ser或Tyr）磷酸化并适当保护，然后按照正常SPPS 合成流程将磷酸化单体缩合到多肽指定位点。这种方法操作简便，已经成为多肽单位点 磷酸化修饰的主要方法。
2）多肽序列在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化：
采用将磷酸化单体缩合到多肽中的方法进行磷酸化修饰时，磷酸化的氨基酸由于侧链修 饰的较大基团产生的位阻而导致难以与肽链缩合，并且之后的氨基酸引入都会比较困难， 尤其在含有多个磷酸化位点修饰时，合成将变得异常困难，并且最终产物成分复杂，难 以分离，产率极低。
因此，当肽链中多个位点进行磷酸化时，可以考虑采用将多肽序列 在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化：其合成过程主要 就是在多肽合成结束之后，选择性的脱去要标记氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可 以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应。
侧链保护基在1%TFA/DCM条件下可以定量的脱 除。采用这种方法时，可以采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体， 连接到羟基上，然后在过氧酸条件下氧化生成磷酰基，完成反应。
G I Welsh, et al. Peptide substrates suitable for assaying glycogen synthase kinase-3 in crude cell extracts.Anal Biochem. 1997 Jan 1;244(1):16-21. : https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9025901/
多肽H2N-Arg-Arg-Ala-Ala-Glu-Glu-Leu-Asp-Ser-Arg-Ala-Gly-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-COOH的合成步骤：
1、合成CTC树脂：称取1.94g CTC Resin（如初始取代度约为1.09mmol/g）和2.54mmol Fmoc-Leu-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入6.34mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到 Fmoc-Leu-CTC Resin。结构图如下：
2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Leu-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：
3、缩合：取6.34mmol Fmoc-Gln(Trt)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入12.69mmol DIPEA，6.03mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：
4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到
H2N-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
Fmoc-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
H2N-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
H2N-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
Fmoc-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
H2N-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
Fmoc-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
H2N-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
H2N-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
Fmoc-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
H2N-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
H2N-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
H2N-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
H2N-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
H2N-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
Fmoc-Ala-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
H2N-Ala-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
H2N-Arg(Pbf)-Ala-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin
以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。
最后再经过步骤二得到 H2N-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin，结构如下：
5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-Arg-Arg-Ala-Ala-Glu-Glu-Leu-Asp-Ser-Arg-Ala-Gly-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-COOH。结构图见产品结构图。
切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%
2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%
3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%
（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）
6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。
7、最后总结：
杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽等。
以上所有内容，为专肽生物原创内容，请勿发布到其他网站上。
