专肽生物_定制多肽合成服务_多肽合成定制服务_多肽合成厂家_多肽合成公司

Thrombin substrate.kcat = 0.032, Km = 160 uM

 Caspase酶对应的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶）是一类蛋白酶家族，其功能与凋亡（程序性细胞死亡），坏死和发烧（炎症）的过程密切相关。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它们是为细胞凋亡的主要介质。多种受体，例如TNF-α 受体，FasL受体，TLR和死亡受体，以及Bcl-2和凋亡抑制剂（IAP）蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦Caspase受到上游信号（外部或内在）刺激被激活，即会参与执行下游蛋白底物的水解作用，并触发一系列事件，导致细胞分解，死亡，吞噬作用和细胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为三大类：第一类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成，他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力。第二类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成，而第三类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分类：

       启动器Caspase和效应器Caspase酶

      根据其在凋亡胱天蛋白酶途径中的作用，胱天蛋白酶可分为两类：启动器和效应器Caspase酶。启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点，Caspase酶的识别位

      凋亡启动器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以启动caspase激活级联反应。Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效应子Caspase（例如Caspase 3）并介导线粒体中细胞色素c的释放。Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性。凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7虽然不负责启动级联途径，但是当被激活时，它们在级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是关键效应器，因为它放大了来自启动器Caspase的信号，使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测，可以检测Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制剂

      Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成：Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同，一般由三个或四个氨基酸组成（表2）。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基团修饰，以增强膜的通透性。对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点，释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的显色底物

      Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成，常见的生色团有pNA（对硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶标仪或分光光度计在405 nm处进行光密度检测。

       表3. Caspase的显色底物

       Caspase的荧光底物

      Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于两步裂解过程，其动态范围更窄。 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定，而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。

      图.从左到右，分别是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激发和发射光谱。

       表4.荧光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波长处的摩尔消光系数（单位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性缓冲液（pH 7.2）中的荧光量子产率。

       Caspase抑制剂

      Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接，通常，Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列，诸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的，而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用，因此，它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂

多肽荧光标记由于没有放射性，实验操作简单。因此，目前在生物学研究中多肽荧光标记应用非常广泛，多肽荧光标记方法与荧光试剂的结构有关系，对于有游离羧基的采用的方法与接多肽反应相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法连接。 在N端标记FITC的多肽需经历环化作用来形成荧光素，通常会伴有最后一个氨基酸的去除，但当有一个间隔器如氨基己酸，或者是通过非酸性环境将目的多肽从树脂上切下来时，这种情况可避免在切割的过程中被TFA切割掉。
        人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性，并将 其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发（例如，各种激 酶、磷酸酶、肽酶等）。
        专肽生物能够提供技术成熟的各种荧光标记多肽。
 

下面是一些常见的多肽修饰荧光物质结构：




FITC标记
 

      FITC(异硫氰酸荧光素)具有比较高的活性，我们公司可以通过两种方式将FITC标记于多肽 上：(1) 将FITC标记于赖氨酸（Lys）或被选择性地脱保护的鸟氨酸（ornithine）侧链氨基 上；(2) 将FITC标记于多肽N端氨基。

      当在N端标记时，建议在最后一个氨基和由异硫氰酸酯与氨基反应产生的硫脲键之间引入 烷基间隔器（alkyl spacer），如氨基己酸（Ahx）。链接切割需要酸性环境，在N端标记FITC 的多肽需经历环化作用来形成荧光素，通常会伴有最后一个氨基酸的去除，但当有一个间隔器 如氨基己酸，或者是通过非酸性环境将目的肽从树脂上切下来时，这种情况可避免。空间位阻 被认为是在荧光染料前使用Ahx的主要原因，而不是为什么FITC不能直接偶联在多肽上的原因。

      Ahx或b-Ala均可作为间隔器用于FITC标记的多肽上。

普通荧光修饰

通过Lys侧链氨基连接的荧光修饰

专肽常做的荧光物质的激发光波长和发射光波长。可供参考选择：