凝血酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的良好底物。凝血酶对 Bz-FVR-pNA 的切割也可用于抗凝血酶 III（肝素辅因子）的简单光度测定。cruzipain 和枯草杆菌蛋白酶的显色底物。
编号：154956
CAS号：54799-93-8
单字母：Bz-FVR-pNA
| 编号: | 154956 |
| 中文名称: | 标记肽Bz-FVR-对硝基苯胺.HCl |
| 英文名: | Bz-Phe-Val-Arg-pNA |
| CAS号: | 54799-93-8 |
| 单字母: | Bz-FVR-pNA |
| 三字母: | Benzoyl N端苯甲酸修饰 -Phe苯丙氨酸 -Val缬氨酸 -Arg精氨酸 -pNA对硝基苯胺 |
| 氨基酸个数: | 3 |
| 分子式: | C33H40O6N8 |
| 平均分子量: | 644.72 |
| 精确分子量: | 644.31 |
| 等电点(PI): | - |
| pH=7.0时的净电荷数: | 1 |
| 平均亲水性: | -0.33333333333333 |
| 疏水性值: | 0.83 |
| 消光系数: | - |
| 来源: | 人工化学合成，仅限科学研究使用，不得用于人体。 |
| 盐体系: | 可选TFA、HAc、HCl或其它 |
| 储存条件: | 负80℃至负20℃ |
| 标签: | pNA修饰肽 三肽 |
A very good substrate for thrombin, trypsin, and papain. Bz-FVR-pNA cleavage by thrombin can also be used for a simple photometric assay of antithrombin III (heparin cofactor). Chromogenic substrate for cruzipain and subtilisin.
| DOI | 名称 | |
|---|---|---|
| 10.1046/j.1432-1033.2003.03593.x | Expression, purification and characterization of the second Kunitz-type protease inhibitor domain of the human WFIKKN protein | 下载 |
| 10.1159/000214093 | Photometric assay of antithrombin III with a chromogenic substrate | 下载 |
| 10.1016/s0165-022x(03)00106-4 | Applying the increase in rate constants of cooperative proteolysis to the determination of transition curves of protein denaturation | 下载 |
| 10.1016/j.exppara.2003.08.001 | Trypanosoma cruzi: partial characterization of minor cruzipain isoforms non-adsorbed to Concanavalin A-Sepharose | 下载 |
| 10.1016/j.intimp.2003.12.010 | Proteolytic activity and immunogenicity of oral bromelain within the gastrointestinal tract of mice | 下载 |
| 10.1093/jxb/erh247 | A comparative study of the role of the major proteinases of germinated common bean (Phaseolus vulgaris L.) and soybean (Glycine max (L.) Merrill) seeds in the degradation of their storage proteins | 下载 |
| 10.1016/j.intimp.2004.12.007 | Proteinase activity and stability of natural bromelain preparations | 下载 |
| 10.1016/j.dci.2006.01.004 | A five-domain Kazal-type serine proteinase inhibitor from black tiger shrimp Penaeus monodon and its inhibitory activities | 下载 |
| 10.1111/j.1742-4658.2006.05483.x | Isoquinoline-1,3,4-trione and its derivatives attenuate beta-amyloid-induced apoptosis of neuronal cells | 下载 |
| 10.1111/j.1742-4658.2008.06333.x | Functional domains of the human epididymal protease inhibitor, eppin | 下载 |
| 10.1016/j.dci.2008.06.005 | Shrimp single WAP domain (SWD)-containing protein exhibits proteinase inhibitory and antimicrobial activities | 下载 |
| 10.1021/jf104919v | Effect of wine inhibitors on free pineapple stem bromelain activity in a model wine system | 下载 |
| 10.1016/j.febslet.2011.10.009 | Role of a propeller loop in the quaternary structure and enzymatic activity of prolyl dipeptidases DPP-IV and DPP9 | 下载 |
| 10.1021/np300282a | Thrombin inhibitors from the freshwater cyanobacterium Anabaena compacta | 下载 |
| 10.1002/btpr.1639 | Pineapple stem bromelain immobilized on different supports: catalytic properties in model wine | 下载 |
| 10.1002/btpr.2015 | Effect of wine inhibitors on the proteolytic activity of papain from Carica papaya L. latex | 下载 |
| 10.1016/s0076-6879(81)80030-4 | Assay of coagulation proteases using peptide chromogenic and fluorogenic substrates | 下载 |
| 10.1016/0003-9861(81)90103-x | Effect of hydroxynitrobenzylation of tryptophan-177 on reactivity of active site cysteine-25 in papain | 下载 |
| 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a132305 | The action of trypsin on synthetic chromogenic arginine substrates | 下载 |
| 10.1016/j.pep.2008.06.003 | Purification and enzymological characterization of murine neurotrypsin | 下载 |
多肽Benzoyl-Phe-Val-Arg-pNA的合成步骤：
1、合成CTC树脂：称取2.83g CTC Resin（如初始取代度约为0.47mmol/g）和1.6mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入3.99mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到 Fmoc-Arg(Pbf)-CTC Resin。结构图如下：
2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Arg(Pbf)-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：
3、缩合：取3.99mmol Fmoc-Val-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入7.98mmol DIPEA，3.79mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Val-Arg(Pbf)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：
4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到
H2N-Val-Arg(Pbf)-CTC Resin
Fmoc-Phe-Val-Arg(Pbf)-CTC Resin
以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。
最后再经过步骤二得到 H2N-Phe-Val-Arg(Pbf)-CTC Resin，结构如下：
5、苯甲酸反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入3.99mmol苯甲酸到树脂中，再加入7.98mmol DIPEA，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到Benzoyl-Phe-Val-Arg(Pbf)-CTC Resin。 结构如下：
6、全保护切割：配置0.5%TFA/DCM溶液，溶液体积约为树脂体积的3倍。再次用DCM洗涤树脂2遍（去除残留DMF），后将配置好的溶液倒入到反应器中，反应30分钟。抽滤树脂，收集滤液（此时多肽已经从树脂上分离，存在于滤液中）。多肽序列为 Benzoyl-Phe-Val-Arg(Pbf)-CTC Resin。 在滤液中添加DIEPA，调PH至7-8。用饱和NaHCO3洗涤滤液，分离出DCM层溶液。可适当旋蒸DCM层溶液，减少有机溶剂。再次加入1或2倍体积的乙酸乙酯，用稀HCl溶液调PH至微酸性，将多肽从DCM层萃取到乙酸乙酯层。用饱和NaCl洗涤2次乙酸乙酯层。用无水硫酸镁吸收乙酸乙酯层的水分。通过减压旋蒸，直接将乙酸乙酯完全旋蒸掉，得到晶体状固体多肽，用于下一步C端反应。或通过减压旋蒸保留适量乙酸乙酯的溶液体积，加入冰乙醚析出 多肽，然后对多肽进行烘干操作即可用于下一步C端反应。Benzoyl-Phe-Val-Arg(Pbf)-COOH的结构图如下。
7、4-硝基苯胺反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入3.99mmol 4-硝基苯胺到树脂中，再加入7.98mmol DIPEA、3.79mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到 Benzoyl-Phe-Val-Arg(Pbf)-pNA。 结构如下：
8、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品Benzoyl-Phe-Val-Arg-pNA。结构图见产品结构图。
切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%
2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%
3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%
（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）
9、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。
10、最后总结：
杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽
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