荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物，受到紫外光或蓝紫光照射时，可激发成为激发态，当从激发态恢复基态时，发出荧光。荧光标记技术指利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记的无放射物污染，操作简便等优点，使得荧光标记物在许多研究领域的应用日趋广泛。人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性，并将其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发（例如，各种激酶、磷酸酶、肽酶等）。专肽生物经过长期开发，能够提供技术成熟的各种荧光标记多肽。

• 荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET)

  

        荧光共振能量转移（FRET)是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程。此过程没有光子的参与，所以是非辐射的。该分析方法具有快速、敏感和简单等优点。
        用于FRET试验的染料是可以相同的。但在大多数应用中其实是使用不同的染料。例如，一个供体基团（EDANS）和接受基因（DABCYL）匀被连接到一HIV蛋白酶的天然底物上，当该底物未被切断时，DABCYL可淬灭EDANS，从而检测不到荧光。当该底物被HIV-1蛋白酶切断后，EDANS不再被DABCYL淬灭，随即可检测到EDANS荧光。蛋白酶抑制剂的有效性可凭借EDANS荧光强度的变化进行监测。
        FRET肽是研究肽酶特异性的便利工具，由于其反应过程可被连续监测，为酶活性的检测提供了一个便捷的方法。供体/受体对的肽键水解后产生的荧光可衡量纳摩尔级浓度的酶活性。当FRET肽是完整的，表现出的是内部的荧光猝灭，但当供体/受体对的任何肽键断裂就会释放出荧光，此荧光可被连续检测，从而可对酶的活性进行定量分析。FRET 肽可作为各类酶研究的合适底物，比如：肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的动力特征和功能特征；对新的蛋白水解酶的筛选和检测；对多肽折叠的构象研究等。

1、常用FRET的标准染料组合。

2、FRET共振能量转移引发荧光猝灭的激发与发射波

3、常规RET供体(Donor)-接受(Aceptor)对的福斯特临界距离(Forster Critical Distance)

FRET荧光共振能量转移

对于分子生物学来讲，生物分析手段的发展，是阐明机理的必要条件。在研究分子间相互作用的道路上，人们不断探索，总结出很多方法，免疫技术，晶体衍射，核磁共振等。1948年，荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）理论被首次提出，它可以测定1.0-6.0nm距离内分子间的相互作用。1967年，这一理论得到了实验验证，将1.0-6.0nm的距离称为光学尺。二十世纪八十年代出，通过科学家的不断探索，Fret技术成功运用到蛋白质结构的研究中。自Fret荧光共振能量技术诞生以来，已结合多种先进的技术和方法，如电子显微镜，X射线衍射等，推动了分子生物学检测手段的发展。

1、作用原理

荧光共振能量转移技术，是采用物理方法去检测分子间的相互作用的方法。他适用于在细胞正常的生理条件下，验证已知分子间是否存在相互作用。此方法的检测原理如下；

将我们要检测的蛋白（如图X和Y），分别偶联上D和A荧光蛋白，D和A是一对荧光物质，我们称之为供体（donor）和受体（acceptor）。当用430nm的紫光去激发X融合蛋白时，它能够产生490nm的蓝色荧光；同样，当我们用490nm的蓝光去激发Y融合蛋白时，它能够产生530nm的黄色荧光。（结合图1） 。

当蛋白X和Y间没有相互作用时（两者的空间距离>10nm），融合蛋白X和Y分别产生相应的荧光而被检测到，

如果蛋白X和Y间存在相互作用（两者的空间距离需<10nm，结合图2），用紫光激发融合蛋白X其产生的蓝光会被融合蛋白Y吸收，从而产生黄色荧光，这时，在细胞内将检测不到蓝色荧光的存在。这时因为能量从X融合蛋白转移到了Y融合蛋白，这就是荧光共振能量转移技术。

2、技术难点

一个理想的Fret相互作用体系，要求要有一对合适的荧光物质， 即供体的发射光谱与受体的吸收光谱有明显的重叠。且当供体的激发波长时对受体无影响，供体和受体的发射光谱要完全分开，否则容易造成光谱干涉，而使反应体系不稳定。目前，较为常用的供体-受体分子对，主要有绿色荧光蛋白类（GFPs）和染料类。绿色荧光蛋白类有CFP-YFP，BFP-GFP，BFP-YFP等，染料类的有Cy3-Cy5，FITC-Rhodamine等。且这些荧光物质要能够标记在研究对象上。

3、应用要求

• 供体荧光基团和受体荧光基团的空间距离要<10nm；
• 供体的发射光谱与受体的接收光谱有相当的重叠；
• 供体、受体分子在量子产率、消光系数、水溶性、抗干扰能力等方面要求较高。

4、优缺点

5、应用

• 细胞内分子间的相互作用
• 膜蛋白的研究
• 细胞膜受体蛋白间的相互作用
• 细胞凋亡的研究
• 核酸检测

6、实验流程简述

以荧光物质CFP（供体）-YFP（受体）为例，检测AB蛋白在细胞内的相互作用。

1. 细胞培养：根据实验培养特定的细胞用于转染，观察检测分子在细胞内的相互作用；
2. 细胞转染：构建质粒载体CFP-A和YFP-B，将检测的AB蛋白分别偶联上荧光蛋白CFP和YFP，并将两个质粒共转染到培养的细胞内；
3. 检测 FRET：质粒载体CFP-A和YFP-B转染细胞 10h、12h、18h、24h、36h、48h、72h 后检测，是否发生Fret；
4. FRET图像采集： 确定 FRET 配对的激发波长， 蓝光被调谐分别用于探测最大和最小的供体和受体信号， 最大供体信号和最小受体信号对应的波长用于收集双表达细胞的 FRET信号。调整激光变化，以便获取最大 CFP 信号和最小 YFP 信号的激发光波长， 采集供体和受体图像，收集 FRET 信号。每个细胞 FRET 检测重复 3 次，每种转染至少完成 6 个细胞的 FRET 检测;
5. FRET 数据处理： 去除 FRET 信号中 DSBT 和 ASBT 的光谱串色信号； 受体通路的FRET 信号需要对供体受体光谱灵敏度的变化进行矫正、对自发荧光和光学噪声进行矫正； 利用矫正系数对双标定细胞进行象素匹配矫正。

7、案例

最常见的一对标记组合是 Dancyl和Edans，

在本例中，荧光团 (EDANS) 和猝灭剂 (DABCYL) 与 HIV 蛋白酶的天然底物相连。在未裂解的底物中，DABCYL 淬灭 EDANS，因此没有可检测到的荧光。底物被 HIV-1 蛋白酶切割后，DABCYL 不再淬灭 EDANS，从而检测到 EDANS 荧光。然后可以监测 EDANS 荧光强度的变化以评估蛋白酶抑制剂的效率。

FRET 肽可用于研究肽酶特异性，因为它们可以连续监测反应，从而快速确定酶活性。供体/受体对之间的肽键可以被切割，从而产生荧光信号以测量纳摩尔浓度的酶活性。当未被切割时，FRET 肽会淬灭内部荧光；然而，供体/受体对之间肽键的断裂会释放出可以连续检测到的荧光信号，从而可以量化酶的活性。

FRET 肽在许多不同的酶研究中用作合适的底物：

肽酶、蛋白酶、激酶和磷酸酶的动力学和功能表征。
筛选和检测新型蛋白水解酶。
肽折叠的构象研究。

多肽荧光标记由于没有放射性，实验操作简单。因此，目前在生物学研究中多肽荧光标记应用非常广泛，多肽荧光标记方法与荧光试剂的结构有关系，对于有游离羧基的采用的方法与接多肽反应相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法连接。 在N端标记FITC的多肽需经历环化作用来形成荧光素，通常会伴有最后一个氨基酸的去除，但当有一个间隔器如氨基己酸，或者是通过非酸性环境将目的多肽从树脂上切下来时，这种情况可避免在切割的过程中被TFA切割掉。
        人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性，并将 其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发（例如，各种激 酶、磷酸酶、肽酶等）。
        专肽生物能够提供技术成熟的各种荧光标记多肽。
 

下面是一些常见的多肽修饰荧光物质结构：




FITC标记
 

      FITC(异硫氰酸荧光素)具有比较高的活性，我们公司可以通过两种方式将FITC标记于多肽 上：(1) 将FITC标记于赖氨酸（Lys）或被选择性地脱保护的鸟氨酸（ornithine）侧链氨基 上；(2) 将FITC标记于多肽N端氨基。

      当在N端标记时，建议在最后一个氨基和由异硫氰酸酯与氨基反应产生的硫脲键之间引入 烷基间隔器（alkyl spacer），如氨基己酸（Ahx）。链接切割需要酸性环境，在N端标记FITC 的多肽需经历环化作用来形成荧光素，通常会伴有最后一个氨基酸的去除，但当有一个间隔器 如氨基己酸，或者是通过非酸性环境将目的肽从树脂上切下来时，这种情况可避免。空间位阻 被认为是在荧光染料前使用Ahx的主要原因，而不是为什么FITC不能直接偶联在多肽上的原因。

      Ahx或b-Ala均可作为间隔器用于FITC标记的多肽上。

普通荧光修饰

通过Lys侧链氨基连接的荧光修饰

专肽常做的荧光物质的激发光波长和发射光波长。可供参考选择：
 

多肽DABCYL-Gaba-Pro-Gln-Gly-Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys-NH2的合成步骤：

1、合成MBHA树脂：取若干克MBHA树脂（如初始取代度为0.5mmol/g）和1倍树脂摩尔量的Fmoc-Linker-OH加入到反应器中，加入DMF，搅拌使氨基酸完全溶解。再加入树脂2倍量的DIEPA，搅拌混合均匀。再加入树脂0.95倍量的HBTU，搅拌混合均匀。反应3-4小时后，用DMF洗涤3次。用2倍树脂体积的10%乙酸酐/DMF 进行封端30分钟。然后再用DMF洗涤3次，甲醇洗涤2次，DCM洗涤2次，再用甲醇洗涤2次。真空干燥12小时以上，得到干燥的树脂{Fmoc-Linker-MHBA Resin}，测定取代度。这里测得取代度为 0.3mmol/g。结构如下图：

2、脱Fmoc：取1.1g的上述树脂，用DCM或DMF溶胀20分钟。用DMF洗涤2遍。加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Linker-MBHA Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取0.99mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入1.98mmol DIPEA，0.94mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gly-Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Gly-Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gln(Trt)-Gly-Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Gln(Trt)-Gly-Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Gln(Trt)-Gly-Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Gln(Trt)-Gly-Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gaba-Pro-Gln(Trt)-Gly-Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Gaba-Pro-Gln(Trt)-Gly-Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin，结构如下：

5、4-二甲胺偶氮苯-4’-羧酸(DABCYL)反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入0.99mmol 4-二甲胺偶氮苯-4’-羧酸(DABCYL)到树脂中，再加入1.98mmol DIPEA、0.94mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到DABCYL-Gaba-Pro-Gln(Trt)-Gly-Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHAResin。 结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品DABCYL-Gaba-Pro-Gln-Gly-Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys-NH2。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽

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