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免疫疗法已成为癌症患者的一种有前景的替代治疗手段。在临床试验中，阻断免疫检查点（如CTLA-4和PD-1）已被证实是癌症治疗的有效方法。靶向PD-L1的单克隆抗体已获美国食品药品监督管理局批准用于治疗尿路上皮癌、非小细胞肺癌或默克尔细胞癌。然而，抗体的高昂成本可能会限制其应用。在文章的研究中，通过细菌表面展示方法，鉴定出了特异性高亲和力结合PD-L1的肽（TPP-1）。通过T细胞活化试验和混合淋巴细胞反应，验证了TPP-1能够干扰PD-1/PD-L1的相互作用。为了检测TPP-1在体内对肿瘤生长的抑制作用，建立了使用H460细胞的异种移植小鼠模型。TPP-1或PD-L1抗体治疗的小鼠肿瘤生长速度分别比对照肽治疗的小鼠低56%或71%，表明TPP-1能够抑制或至少延缓肿瘤生长。肿瘤的免疫组化结果显示，在TPP-1或PD-L1抗体治疗组中，IFNγ和颗粒酶B的表达增加，这表明TPP-1可减弱PD-L1对T细胞的抑制作用，T细胞可能重新被激活。根据文章的数据，TPP-1肽可作为抗体的替代品用于肿瘤免疫治疗。

通过流式细胞术初步分析了展示在细菌表面的肽的结合特性。在使用2 nmol/L的PD-L1时，克隆1和克隆3显示出显著高于克隆2和随机文库克隆的结合能力。随着PD-L1浓度从0.2增加到4.8 nmol/L，克隆1和克隆3的结合特性表现出相同的趋势。在与PD-L1孵育后进行严格的洗涤程序时，克隆1和克隆3的结合能力显著下降。克隆1和克隆3的下降程度相似。在相应的孵育系统中加入BSA、IL4、IFNγ或bFGF均未影响结合能力。所有这些结果表明，克隆1和克隆3在结合亲和力和特异性方面比克隆2更好，且彼此之间没有显著差异。

克隆1和克隆3的肽被合成，溶解性测试表明克隆3在无菌水中比克隆1更容易溶解，因此，选择克隆3用于后续实验，并命名为TPP-1（靶向PD-L1肽1）。基于ELISA结果，使用了一个随机的TPP-1肽（SPP-1）作为对照

综合来看，文章已经证明TPP-1肽可以特异性地与PD-L1相互作用并阻断PD-1/PD-L1相互作用。它有可能替代抗体在癌症免疫治疗中的作用。一旦建立了适当的递送系统，具有高亲和力和特异性的肽可能成为靶向治疗的有效候选者。

二硫键广泛存在与蛋白结构中，对稳定蛋白结构具有非常重要的意义，二硫键一般是通过序列中的2个Cys的巯基，经氧化形成。
 

形成二硫键的方法很多：空气氧化法，DMSO氧化法，过氧化氢氧化法等。
 

二硫键的合成过程，  可以通过Ellman检测以及HPLC检测方法对其反应进程进行监测。  
   

如果多肽中只含有1对Cys，那二硫键的形成是简单的。多肽经固相或液相合成，然后在pH8-9的溶液中进行氧化。      
 

当需要形成2对或2对以上的二硫键时，合成过程则相对复杂。尽管二硫键的形成通常是在合成方案的最后阶段完成，但有时引入预先形成的二硫化物是有利于连合或延长肽链的。通常采用的巯基保护基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多种基团。我们分别列出两种以2-Cl树脂和Rink树脂为载体合成的多肽上多对二硫键形成路线：
 

二硫键反应条件选择    
 

 二硫键即为蛋白质或多肽分子中两个不同位点Cys的巯基（-SH）被氧化形成的S-S共价键。 一条肽链上不同位置的氨基酸之间形成的二硫键，可以将肽链折叠成特定的空间结构。多肽分 子通常分子量较大，空间结构复杂，结构中形成二硫键时要求两个半胱氨酸在空间距离上接近。 此外，多肽结构中还原态的巯基化学性质活泼，容易发生其他的副反应，而且肽链上其他侧链 也可能会发生一系列修饰，因此，肽链进行修饰所选取的氧化剂和氧化条件是反应的关键因素， 反应机理也比较复杂，既可能是自由基反应，也可能是离子反应。      

反应条件有多种选择，比如空气氧化，DMSO氧化等温和的氧化过程，也可以采用H2O2，I2， 汞盐等激烈的反应条件。
 

空气氧化法： 空气氧化法形成二硫键是多肽合成中最经典的方法，通常是将巯基处于还原态的多肽溶于水中，在近中性或弱碱性条件下（PH值6.5-10），反应24小时以上。为了降低分子之间二硫键形成的可能，该方法通常需要在低浓度条件下进行。
 

碘氧化法：将多肽溶于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，逐滴滴加10-15mol/L的碘进行氧化，反应15-40min。当肽链中含有对碘比较敏感的Tyr、Trp、Met和His的残基时，氧化条件要控制的更精确，氧化完后，立即加入维生素C或硫代硫酸钠除去过量的碘。 当序列中有两对或多对二硫键需要成环时，通常有两种情况：
 

自然随机成环:       序列中的Cys之间随机成环，与一对二硫键成环条件相似；
 

定点成环：       定点成环即序列中的Cys按照设计要求形成二硫键，反应过程相对复杂。在 固相合成多肽之前，需要提前设计几对二硫键形成的顺序和方法路线，选择不同的侧链 巯基保护基，利用其性质差异，分步氧化形成两对或多对二硫键。       通常采用的巯基保护 基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多种基团。

靶向多肽可以根据其功能和用途分为不同的类别。在PDC（多肽偶联药物）中，靶向多肽通常被分为细胞穿透肽和细胞靶向肽两大类。

细胞穿透肽：这类多肽能够跨越细胞膜，转运具有生物活性的大分子物质，如多肽、蛋白质、核酸等化学药物，使其顺利进入细胞。一些常见的细胞穿透肽包括Pep-1、Pentratin、PepFact14、Transportan等。

细胞靶向肽：这类多肽的作用主要是引导化学药物或生物活性分子与特定类型的细胞结合，以提高其靶向性和治疗效率。常见的细胞靶向肽包括PEGA、生长激素抑制素类似物、蛙皮素类似物、RGD肽类等。