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这是 N 端生物素化肽。序列 APRTPGGRR 包含源自牛髓鞘碱性蛋白 95-98 位氨基酸（PRTP）的天然序列。其余序列并非源自天然序列，而是合成构建体。该底物对 MAP 激酶具有特异性：p44MAPK 细胞外信号调节激酶 1（ERK1） 和 p42MAPK（ERK2）。它含有 MAP 激酶识别的共有序列 Pro-X-（Ser/Thr）-Pro。该肽是 ERK 磷酸化反应最有效的底物。该底物在苏氨酸 97 位被激酶磷酸化，也可被 MAPK p38 磷酸化。

This is an N-terminally biotinylated peptide. The sequence APRTPGGRR contains a native sequence derived from bovine myelin basic protein amino acids 95-98 (PRTP). The rest of the sequence is not derived from a native sequence, but is a synthetic construct. This substrate is specific for MAP kinases: p44MAPK extracellular signal-regulated kinase 1 (ERK1) and p42MAPK (ERK2). It contains the consensus sequence Pro-X-(Ser/Thr)-Pro that is recognized by MAP kinase. This peptide is the most efficient substrate for phosphorylation reaction by ERK. The substrate is phosphorylated by kinases on threonine 97 and can also be phosphorylated by MAPK p38.

Biotin-myelinbasicprotein(94-102)是一个多肽片段。髓鞘碱性蛋白(Myelinbasicprotein)负责粘附多层紧密髓鞘的细胞表面，它在神经系统中神经髓鞘形成过程中起着重要作用。髓鞘碱性蛋白还作为一种膜肌动蛋白结合蛋白，这可能使它参与细胞外信号向少突胶质细胞的细胞骨架和髓鞘的紧密连接的传递。 髓鞘碱性蛋白（MBP）是中枢神经系统髓鞘中含量第二丰富的蛋白质，负责多层致密髓鞘胞质面的黏附作用。作为"天然无序"或构象适应性蛋白家族成员，该蛋白还具有多项其他功能：既能与肌动蛋白、微管蛋白、钙调素及网格蛋白等多种聚阴离子蛋白相互作用，也可结合带负电荷的脂质，并在结合过程中形成特定结构。它可能作为膜结合肌动蛋白发挥作用，从而参与少突胶质细胞胞外信号向细胞骨架的传递，以及髓鞘紧密连接的形成。某些MBP亚型可转运至细胞核，表明其还可能结合多核苷酸。髓鞘或培养少突胶质细胞接收的胞外信号会引起MBP磷酸化状态改变，提示该蛋白也参与信号传导。对这一高丰度蛋白的深入研究将揭示少突胶质细胞和髓鞘如何利用其实现多种生物学功能。 MBP（髓鞘碱性蛋白）作为一种天然无序的碱性蛋白，能够结合并使其结构适应多种聚阴离子表面（如脂质双分子层、肌动蛋白、微管蛋白和网格蛋白），并可能结合多核苷酸，在少突胶质细胞和髓鞘中具有多重功能。除介导致密髓鞘胞质面黏附外，该蛋白还能与细胞骨架相互作用并将其锚定在膜表面，并可能参与将细胞外信号传导至细胞骨架和/或紧密连接。该蛋白存在多种不同大小的亚型和电荷异构体，以及诸多翻译后修饰，这些特性可增强并调控其多功能性。 MBP介导的肌动蛋白丝与膜结合过程可能受到以下因素的调控：影响膜表面电荷的带负电脂质与中性脂质比例变化、MBP磷酸化状态、以及细胞内钙离子水平对钙调蛋白的调节——这些变化均发生于信号传导过程中。此外，发育分化过程中发生的脱亚胺修饰及大小亚型表达变化，也可能调控其与细胞骨架的相互作用。 翻译后修饰作用同样影响MBP蛋白与细胞膜的相互作用及其构象变化。MBP电荷异构体阳离子性的降低会阻碍该蛋白的膜粘附与组装活性。这一机制可能在轴突包裹和髓鞘致密化开始前，对少突胶质细胞（OL）的膜形成过程具有生理意义，并参与调控髓鞘内含胞质区域的体积。MBP促使胞质表面粘附的能力对膜表面电荷与盐浓度极为敏感，这种特性使得该功能可能通过神经元活动期间胞质区域对K+或Ca2+的摄取、或pH值波动进行调控。在致密髓鞘中，富含糖鞘脂（GSL）的膜结构域在相对的细胞外表面形成的接触（糖突触）可能触发信号传导，这些信号被传递至MBP与细胞骨架。该过程可能调控紧密连接孔道的开闭状态，以及致密髓鞘细胞外间隙的离子与水含量。 翻译后修饰可能通过破坏髓鞘稳定性而具有病理作用。脱亚胺化反应会使蛋白质进一步变性，即使与脂质结合时也是如此，并导致C端半部更易被酶和蛋白酶接触。其中一个暴露于蛋白酶的区域是1956年J·M·博格斯发现的髓鞘碱性蛋白免疫优势表位。在细胞质膜表面更大的暴露度，可能导致这个强致脑炎性表位被切割释放，从而在多发性硬化症中引发或维持对MBP的免疫反应。
 

生物素可以与亲和素或者链霉亲和素有力结合，结合强度甚至接近共价键。生物素标记的肽通常用于免疫测定，组织细胞化学和基于荧光的流式细胞术。标记的抗生物素抗体也可以用来结合生物素化多肽。生物素标记常连接在赖氨酸侧链或者N末端。通常在多肽和生物素之间使用6-氨基己酸作为纽带，纽带能够灵活结合底物，并且在有空间位阻的情况下能结合地更好。专肽生物根据需求，向客户提供具有不同位点生物素标记多肽的定制合成。

专肽生物合成用于蛋白质-蛋白质相互作用研究的生物素化肽。尽管生物素可以在 N 端或 C 端引入（通过赖氨酸残基），但我们建议使用 N 端修饰，因为它成本低、成功率高、周转时间短且易于操作。因为多肽合成是从 C 端到 N 端合成的，因此，N 端修饰是 SPPS步骤的最后一步，不需要额外的特定缩合步骤。相比之下，C 端修饰需要额外的步骤，并且通常更复杂。当然，原则上生物素可以定位在任何地方。

生物素可以通过多种不同的接头或间隔物与肽分离。尽管如此，还是建议包含一个灵活的间隔物，例如 Ahx（一个 6 碳接头），以使生物素标签更加稳定或灵活。

专肽生物在 N 端或 C 端提供生物素化：生物素-N 端、赖氨酸-生物素-肽中间和赖氨酸-生物素-C 端。
专肽生物还可以使用 Ahx 接头或长碳 (LC) 接头提供生物素化：生物素-Ahx-N 末端、Lys-Ahx-生物素-肽中间、Lys-Ahx-生物素-C-末端。

（生物素结构）

示例：
GRGDS在N端和C端标记生物素的结构展示。

1、GRGDS在N端标记生物素，不增加Ahx 接头

2、GRGDS在N端标记生物素，增加一个Ahx 接头

3、GRGDS在C端标记生物素，不增加Ahx 接头

4、GRGDS在C端标记生物素，增加一个Ahx 接头。

 Caspase酶对应的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶）是一类蛋白酶家族，其功能与凋亡（程序性细胞死亡），坏死和发烧（炎症）的过程密切相关。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它们是为细胞凋亡的主要介质。多种受体，例如TNF-α 受体，FasL受体，TLR和死亡受体，以及Bcl-2和凋亡抑制剂（IAP）蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦Caspase受到上游信号（外部或内在）刺激被激活，即会参与执行下游蛋白底物的水解作用，并触发一系列事件，导致细胞分解，死亡，吞噬作用和细胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为三大类：第一类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成，他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力。第二类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成，而第三类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分类：

       启动器Caspase和效应器Caspase酶

      根据其在凋亡胱天蛋白酶途径中的作用，胱天蛋白酶可分为两类：启动器和效应器Caspase酶。启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点，Caspase酶的识别位

      凋亡启动器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以启动caspase激活级联反应。Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效应子Caspase（例如Caspase 3）并介导线粒体中细胞色素c的释放。Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性。凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7虽然不负责启动级联途径，但是当被激活时，它们在级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是关键效应器，因为它放大了来自启动器Caspase的信号，使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测，可以检测Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制剂

      Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成：Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同，一般由三个或四个氨基酸组成（表2）。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基团修饰，以增强膜的通透性。对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点，释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的显色底物

      Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成，常见的生色团有pNA（对硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶标仪或分光光度计在405 nm处进行光密度检测。

       表3. Caspase的显色底物

       Caspase的荧光底物

      Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于两步裂解过程，其动态范围更窄。 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定，而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。

      图.从左到右，分别是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激发和发射光谱。

       表4.荧光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波长处的摩尔消光系数（单位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性缓冲液（pH 7.2）中的荧光量子产率。

       Caspase抑制剂

      Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接，通常，Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列，诸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的，而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用，因此，它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂

多肽Biotin-Ala-Pro-Arg-Thr-Pro-Gly-Gly-Arg-Arg-COOH的合成步骤：

1、合成CTC树脂：称取1.67g CTC Resin（如初始取代度约为1.15mmol/g）和2.3mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入5.76mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到  Fmoc-Arg(Pbf)-CTC Resin。结构图如下：

2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Arg(Pbf)-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取5.76mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入11.52mmol DIPEA，5.47mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Pro-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Pro-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Pro-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Thr(tBu)-Pro-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Pro-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Pro-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Pro-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Pro-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Ala-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Pro-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Ala-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Pro-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTC Resin，结构如下：

5、生物素反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入5.76mmol 生物素到树脂中，再加入11.52mmol DIPEA、5.47mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到Biotin-Ala-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Pro-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-CTCResin。 结构如下：

6、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品Biotin-Ala-Pro-Arg-Thr-Pro-Gly-Gly-Arg-Arg-COOH。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽

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