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磷酸肽的合成
在生命过程中发挥重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Tyr、Ser，Thr，。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是单苄基磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的连接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用该方法合成磷酸化多肽也有缺点，特别是在合成多磷酸化多肽或氨基酸较长的多肽的时候，连接效率低，最后产品纯度很低，对于这种磷酸化多肽，我们考虑采用后磷酸化方法，其合成过程就是在多肽合成结束后，选择性脱去要标记的氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1% TFA/DCM条件下可以定量的脱除。后磷酸化，采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体，连接到羟基上，随后在过氧酸下氧化生成磷酰基，完成反应。

目前，多肽的磷酸化修饰方法主要有两种：

（1）将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中；

（2）多肽序列在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化。
 

1）将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中：

即事先将需要磷酸化的氨基酸（Thr,Ser或Tyr）磷酸化并适当保护，然后按照正常SPPS 合成流程将磷酸化单体缩合到多肽指定位点。这种方法操作简便，已经成为多肽单位点 磷酸化修饰的主要方法。



 

2）多肽序列在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化：

        采用将磷酸化单体缩合到多肽中的方法进行磷酸化修饰时，磷酸化的氨基酸由于侧链修 饰的较大基团产生的位阻而导致难以与肽链缩合，并且之后的氨基酸引入都会比较困难， 尤其在含有多个磷酸化位点修饰时，合成将变得异常困难，并且最终产物成分复杂，难 以分离，产率极低。
        因此，当肽链中多个位点进行磷酸化时，可以考虑采用将多肽序列 在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化：其合成过程主要 就是在多肽合成结束之后，选择性的脱去要标记氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可 以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应。

        侧链保护基在1%TFA/DCM条件下可以定量的脱 除。采用这种方法时，可以采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体， 连接到羟基上，然后在过氧酸条件下氧化生成磷酰基，完成反应。

磷酸肽的的介绍

在所有的PTM中，磷酸化是最丰富和最重要的修饰之一。磷酸基团是一个高度带负电的分子，在磷原子周围有一个四面体结构。磷酸化多肽主要指肽链中的Ser、Tyr和Thr 残基的侧链羟基被修饰成酸式磷酸酯多肽。许多激素均是通过提高丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基的磷酸化状态来调节特异性酶的活性。磷酸化与人类疾病高度相关。例如，tau、α-synuclein和huntingtin的过度/多重磷酸化与人类疾病高度相关，聚集磷酸化也爆发神经退行性疾病的主要原因之一，例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病。目前，对磷酸化氨基酸的主要研究集中在羟基磷酸单酯型磷酸化氨基酸（O-磷酸化氨基酸），即磷酸化丝氨酸，磷酸化苏氨酸，磷酸化酪氨酸。

专肽生物生物为客户提供pSer、pTyr、pThr和D-pSer、D-pTyr、D-pThr的磷酸化修饰服务，也可以进行二、三、四、五个磷酸化位点修饰的高质量多肽的合成。

多肽H2N-Ala-Ala-Leu-Val-Arg-Gln-Met-Ser(PO3H2)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys-NH2的合成步骤：

1、合成MBHA树脂：取若干克的MBHA树脂（如初始取代度为0.5mmol/g）和1倍树脂摩尔量的Fmoc-Linker-OH加入到反应器中，加入DMF，搅拌使氨基酸完全溶解。再加入树脂2倍量的DIEPA，搅拌混合均匀。再加入树脂0.95倍量的HBTU，搅拌混合均匀。反应3-4小时后，用DMF洗涤3次。用2倍树脂体积的10%乙酸酐/DMF 进行封端30分钟。然后再用DMF洗涤3次，甲醇洗涤2次，DCM洗涤2次，再用甲醇洗涤2次。真空干燥12小时以上，得到干燥的树脂{Fmoc-Linker-MHBA Resin}，测定取代度。这里测得取代度为 0.3mmol/g。结构如下图：

2、脱Fmoc：取1.24g的上述树脂，用DCM或DMF溶胀20分钟。用DMF洗涤2遍。加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Linker-MBHA Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取1.12mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入2.23mmol DIPEA，1.06mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Met-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Met-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gln(Trt)-Met-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Gln(Trt)-Met-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Met-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Met-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Met-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Val-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Met-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Met-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Met-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ala-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Met-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ala-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Met-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ala-Ala-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Met-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Ala-Ala-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Met-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin，结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-Ala-Ala-Leu-Val-Arg-Gln-Met-Ser(PO3H2)-Val-Ala-Phe-Phe-Phe-Lys-NH2。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽等。

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