caspase-8 的底物。Caspase-8 结合并裂解Ile-Glu-Thr-Asp (IETD) 肽序列，释放对硝基苯胺，可通过 405 nm 处的比色检测来定量检测酶活性。
编号：199943
CAS号：219138-21-3
单字母：Ac-IETD-pNA
| 编号: | 199943 |
| 中文名称: | Caspase 8 Substrate 1, chromogenic |
| 英文名: | Caspase 8 Substrate 1, chromogenic |
| CAS号: | 219138-21-3 |
| 单字母: | Ac-IETD-pNA |
| 三字母: | Ac N端乙酰化封端 -Ile异亮氨酸 -Glu谷氨酸 -Thr苏氨酸 -Asp天冬氨酸 -pNA对硝基苯胺 |
| 氨基酸个数: | 4 |
| 分子式: | C27H38O12N6 |
| 平均分子量: | 638.62 |
| 精确分子量: | 638.25 |
| 等电点(PI): | - |
| pH=7.0时的净电荷数: | -2 |
| 平均亲水性: | 0.95 |
| 疏水性值: | -0.8 |
| 外观与性状: | 白色粉末状固体 |
| 消光系数: | - |
| 来源: | 人工化学合成，仅限科学研究使用，不得用于人体。 |
| 纯度: | 95%、98% |
| 盐体系: | 可选TFA、HAc、HCl或其它 |
| 储存条件: | 负80℃至负20℃ |
| 标签: | pNA修饰肽 |
Ac-Ile-Glu-Thr-Asp-pNA 是 caspase-8 的底物。Caspase-8 结合并裂解Ile-Glu-Thr-Asp (IETD) 肽序列，释放对硝基苯胺，可通过 405 nm 处的比色检测来定量检测酶活性。
Ac-Ile-Glu-Thr-Asp-pNA is a substrate for caspase-8. Caspase-8 binds to and cleaves the Ile-Glu-Thr-Asp (IETD) peptide sequence to release p-nitroalinide, which can be quantified by colorimetric detection at 405 nm as a measure of enzyme activity[1].
Smith GK, et al. Expression, preparation, and high-throughput screening of caspase-8: discovery of redox-based and steroid diacid inhibition. Arch Biochem Biophys. 2002;399(2):195-205. : https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11888206/
多肽Ac-Ile-Glu-Thr-Asp-pNA的合成步骤：
1、合成CTC树脂：称取0.45g CTC Resin（如初始取代度约为0.95mmol/g）和0.51mmol Fmoc-Asp(OtBu)-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入1.28mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到 Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin。结构图如下：
2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Asp(OtBu)-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：
3、缩合：取1.28mmol Fmoc-Thr(tBu)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入2.56mmol DIPEA，1.22mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：
4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到
H2N-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin
Fmoc-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin
H2N-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin
Fmoc-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin
以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。
最后再经过步骤二得到 H2N-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin，结构如下：
5、乙酸酐反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入1.28mmol 乙酸酐到树脂中，再加入2.56mmol DIPEA、1.22mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到Ac-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin。 结构如下：
6、全保护切割：配置0.5%TFA/DCM溶液，溶液体积约为树脂体积的3倍。再次用DCM洗涤树脂2遍（去除残留DMF），后将配置好的溶液倒入到反应器中，反应30分钟。抽滤树脂，收集滤液（此时多肽已经从树脂上分离，存在于滤液中）。多肽序列为 Ac-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin。 在滤液中添加DIEPA，调PH至7-8。用饱和NaHCO3洗涤滤液，分离出DCM层溶液。可适当旋蒸DCM层溶液，减少有机溶剂。再次加入1或2倍体积的乙酸乙酯，用稀HCl溶液调PH至微酸性，将多肽从DCM层萃取到乙酸乙酯层。用饱和NaCl洗涤2次乙酸乙酯层。用无水硫酸镁吸收乙酸乙酯层的水分。通过减压旋蒸，直接将乙酸乙酯完全旋蒸掉，得到晶体状固体多肽，用于下一步C端反应。或通过减压旋蒸保留适量乙酸乙酯的溶液体积，加入冰乙醚析出 多肽，然后对多肽进行烘干操作即可用于下一步C端反应。Ac-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-COOH的结构图如下。
7、4-硝基苯胺反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入1.28mmol 4-硝基苯胺到树脂中，再加入2.56mmol DIPEA、1.22mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到 Ac-Ile-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-pNA。 结构如下：
8、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品Ac-Ile-Glu-Thr-Asp-pNA。结构图见产品结构图。
切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%
2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%
3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%
（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）
9、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。
10、最后总结：
杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽
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