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T.Kurihara et al., Peptide Chemistry 1985, Proceedings of the 23rd Symposium, Kyoto, p. 173, Y.Kiso, ed., Protein Res. Foundation, Osaka, (1986)

二硫键广泛存在与蛋白结构中，对稳定蛋白结构具有非常重要的意义，二硫键一般是通过序列中的2个Cys的巯基，经氧化形成。
 

形成二硫键的方法很多：空气氧化法，DMSO氧化法，过氧化氢氧化法等。
 

二硫键的合成过程，  可以通过Ellman检测以及HPLC检测方法对其反应进程进行监测。  
   

如果多肽中只含有1对Cys，那二硫键的形成是简单的。多肽经固相或液相合成，然后在pH8-9的溶液中进行氧化。      
 

当需要形成2对或2对以上的二硫键时，合成过程则相对复杂。尽管二硫键的形成通常是在合成方案的最后阶段完成，但有时引入预先形成的二硫化物是有利于连合或延长肽链的。通常采用的巯基保护基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多种基团。我们分别列出两种以2-Cl树脂和Rink树脂为载体合成的多肽上多对二硫键形成路线：
 

二硫键反应条件选择    
 

 二硫键即为蛋白质或多肽分子中两个不同位点Cys的巯基（-SH）被氧化形成的S-S共价键。 一条肽链上不同位置的氨基酸之间形成的二硫键，可以将肽链折叠成特定的空间结构。多肽分 子通常分子量较大，空间结构复杂，结构中形成二硫键时要求两个半胱氨酸在空间距离上接近。 此外，多肽结构中还原态的巯基化学性质活泼，容易发生其他的副反应，而且肽链上其他侧链 也可能会发生一系列修饰，因此，肽链进行修饰所选取的氧化剂和氧化条件是反应的关键因素， 反应机理也比较复杂，既可能是自由基反应，也可能是离子反应。      

反应条件有多种选择，比如空气氧化，DMSO氧化等温和的氧化过程，也可以采用H2O2，I2， 汞盐等激烈的反应条件。
 

空气氧化法： 空气氧化法形成二硫键是多肽合成中最经典的方法，通常是将巯基处于还原态的多肽溶于水中，在近中性或弱碱性条件下（PH值6.5-10），反应24小时以上。为了降低分子之间二硫键形成的可能，该方法通常需要在低浓度条件下进行。
 

碘氧化法：将多肽溶于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，逐滴滴加10-15mol/L的碘进行氧化，反应15-40min。当肽链中含有对碘比较敏感的Tyr、Trp、Met和His的残基时，氧化条件要控制的更精确，氧化完后，立即加入维生素C或硫代硫酸钠除去过量的碘。 当序列中有两对或多对二硫键需要成环时，通常有两种情况：
 

自然随机成环:       序列中的Cys之间随机成环，与一对二硫键成环条件相似；
 

定点成环：       定点成环即序列中的Cys按照设计要求形成二硫键，反应过程相对复杂。在 固相合成多肽之前，需要提前设计几对二硫键形成的顺序和方法路线，选择不同的侧链 巯基保护基，利用其性质差异，分步氧化形成两对或多对二硫键。       通常采用的巯基保护 基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多种基团。

Coast, G. et al. J. Exp. Biol. 204, 1795 (2001);

Kurihara, T. et al. Peptide Chem. Proceedings of the 23rd Symposium, Kyoto, p.173, Y. Kiso, ed., Protein Res. Foundation, Osaka (1986)

多肽H2N-Cys-Ala-Ser-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2的合成步骤：

1、合成MBHA树脂：取若干克的MBHA树脂（如初始取代度为0.5mmol/g）和1倍树脂摩尔量的Fmoc-Linker-OH加入到反应器中，加入DMF，搅拌使氨基酸完全溶解。再加入树脂2倍量的DIEPA，搅拌混合均匀。再加入树脂0.95倍量的HBTU，搅拌混合均匀。反应3-4小时后，用DMF洗涤3次。用2倍树脂体积的10%乙酸酐/DMF 进行封端30分钟。然后再用DMF洗涤3次，甲醇洗涤2次，DCM洗涤2次，再用甲醇洗涤2次。真空干燥12小时以上，得到干燥的树脂{Fmoc-Linker-MHBA Resin}，测定取代度。这里测得取代度为 0.3mmol/g。结构如下图：

2、脱Fmoc：取2.19g的上述树脂，用DCM或DMF溶胀20分钟。用DMF洗涤2遍。加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Linker-MBHA Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取1.97mmol Fmoc-Pro-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入3.94mmol DIPEA，1.87mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Pro-Linker-MBHA Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Ser(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ala-Ser(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

H2N-Ala-Ser(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Cys(Trt)-Ala-Ser(tBu)-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Val-Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Ser(tBu)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-His(Trt)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(tBu)-Pro-Linker-MBHA Resin，结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-Cys-Ala-Ser-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH2。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽等。

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