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Alloferon 1 是一种抗病毒和抗肿瘤肽。Alloferon 1 刺激人外周血淋巴细胞的天然细胞毒性。Alloferon 1 还可诱导 IFN 合成，并增强小鼠的抗病毒和抗肿瘤抵抗力。Alloferon 1 在 λ-角叉菜胶诱导的足水肿模型中也显示出抗炎活性。Alloferon 1 可以从丽蝇 Calliphora vicina (双翅目) 的血液中分离出来。

这种肽是从一种实验感染的昆虫——毒蝇的血液中分离出来的。体外实验表明，同种异体素1对自然杀伤淋巴细胞具有刺激活性。体内试验表明，在用合成的异费隆治疗后，在小鼠中诱导了IFN的产生。异洛芬在体内具有抗病毒和抗肿瘤的能力。

This peptide was isolated from the blood of an experimentally infected insect, the blow fly Calliphora vicina (Diptera). In vitro experiments reveal that alloferon 1 has stimulatory activities on natural killer lymphocytes. In vivo trials indicate the induction of IFN production in mice after treatments with synthetic alloferon. Alloferon has antiviral and antitumoral capabilities in vivo.

定义
几种病毒肽是 细胞毒性T淋巴细胞 （CTL）表位或H-2Db限制性表位，有助于 T细胞受体识别过程，并在那里 清除被 病毒感染的细胞。

Discovery
Tsomides TJ等人在1994年建立了一种基于稳定稳定地表达从HIV血清阳性个体获得的HIV-1和CTL的新开发细胞系的检测系统。他们鉴定了MHC-1分子内源性呈递的HIV肽¹。可以通过酸洗脱从感染了病毒的细胞中提取此类肽。来自流感病毒核蛋白的天然加工的H–2–Db限制肽和H–2–Kd限制肽均小于相应的合成肽，后者首先用于确定各自的CTL表位。与次要的组织相容性抗原一样，病毒肽的出现似乎严重依赖于MHC I类分子，因为被感染的H-2d细胞不含H-2-Db限制性肽，而被感染的H-2b细胞也不包含HHC-2类。 H-2-Kd限制肽。数据为上述概念提供了直接的实验证据，证明了病毒感染细胞²上与MHC相关的病毒肽的概念。

结构特征
小鼠MHC I类分子（H-2Kb）的X射线结构与两种不同的病毒肽（来自水泡性口炎病毒核蛋白VSV-8和仙台病毒核蛋白SEV-9）复合测定。H-2Kb络合物的VSV-8精制为2.3，SEV-9精制为2.5。H-2Kb的结构与人类HLA I类具有高度相似性，尽管各个结构域的排列可能略有变化。两种肽都以延伸的构象结合，其大部分表面掩埋在H-2Kb结合槽中。纳米单体肽主要通过在其他β构象的中心插入凸起来维持与八聚体相同的氨基和羧基末端相互作用。大多数特异性相互作用是在H-2Kb的侧链原子和肽的主链原子之间。该结合方案在很大程度上解释了以高亲和力结合I类分子的肽序列的巨大多样性。H-2Kb的微小但显着的构象变化与肽结合有关，这些协同运动可能是T细胞受体识别过程不可或缺的一部分³。

行动方式
通过破坏受病毒感染的细胞，受MHC限制的CTL在针对多种病毒的免疫反应中起着核心作用。与抗体不同，CD8 + CTL除了识别来自病毒编码的细胞表面糖蛋白的序列外，还识别来自细胞内病毒蛋白的保守序列。几种病毒表达的基因会下调I类MHC蛋白的表达，从而为它们提供了逃避细胞毒性T淋巴细胞的手段，但使它们易于被NK细胞裂解。I类MHC分子几乎无处不在的表达提供了一种手段，NK细胞可通过这些手段在可能丢失或下调的表面I类MHC分子的修饰靶细胞之间进行区分。I类MHC蛋白的缺失或失调可能部分解释了NK细胞如何调查组织中I类MHC的正常表达，缺失的自我假设。肿瘤细胞下调I类MHC蛋白的表达，而表达I类蛋白的肿瘤细胞则比特异性缺乏I类MHC表达的衍生物更能抵抗NK细胞的杀伤。可以通过转染适当的I类MHC分子来拯救对NK裂解敏感的I类阴性突变细胞系 ^4,5。

功能
消除病毒感染的细胞，可以通过CTL消除病毒感染的细胞，CTL可以识别与细胞表面^2的MHC I类分子结合的病毒衍生肽。

天然杀伤（NK）细胞 被I型主要组织相容性复合物配体的特定同型异型抑制，该配体被多态性抑制受体（例如NKIR1和NKIR2）识别。NK1和NK2特异性克隆识别两组HLA-C同种异型，这些同种异型的特征是在α1螺旋中的残基80（分别为αLys-80和αAsn-80）处具有双态性。谷氨酸脱羧酶或柯萨奇病毒（每种都与自身免疫性糖尿病有关）衍生的肽废除了这种抑制性识别⁶。

感染后1-2周内会出现针对多种HIV产品（例如gag，pol，nef，env）的CD8 + CTL，这些CTL的异常高频率提示了它们的重要性：通常可以在新鲜分离的中检测到它们没有体外抗原刺激的PBMC通常需要证明其在其他病毒感染中的CTL活性  ¹。

参考

1、Tsomides TJ, Aldovini A, Johnson RP, Walker BD, Young RA, Eisen HN (1994). Naturally processed viral peptides recognized by cytotoxic T lymphocytes on cells chronically infected by human immunodeficiency virus type 1. J Exp Med., 180(4):1283-1293.
2、Rötzschke O, Falk K, Deres K, Schild H, Norda M, Metzger J, Jung G, Rammensee HG (1990). Isolation and analysis of naturally processed viral peptides as recognized by cytotoxic T cells. Nature, 348(6298):252-254.
3、Fremont DH, Matsumura M, Stura EA, Peterson PA, Wilson IA (1992). Crystal structures of two viral peptides in complex with murine MHC class I H-2Kb. Science, 257(5072):919-927.
4、Ljunggren H-G, Karre K (1990). In search of the 'missing self': MHC molecules and NK cell recognition. Immunol Today., 11(7):237-244.
5、Kärre K, Ljunggren HG, Piontek G, Kiessling R. (1986). Selective rejection of H-2-deficient lymphoma variants suggests alternative immune defence strategy. Nature, 319:675–678.
6、Mandelboim O, Wilson SB, Valés-Gómez M, Reyburn HT, Strominger JL (1997). Self and viral peptides can initiate lysis by autologous natural killer cells. PNAS., 94(9):4604-4609.

[1]. Chernysh S, et al. Antiviral and antitumor peptides from insects. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Oct 1;99(20):12628-32. 

[2]. Zhang X, et al. Alloferon-1 ameliorates acute inflammatory responses in λ-carrageenan-induced paw edema in mice. Sci Rep. 2022 Oct 6;12(1):16689.  

多肽H2N-His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly-COOH的合成步骤：

1、合成CTC树脂：称取1.56g CTC Resin（如初始取代度约为0.65mmol/g）和1.22mmol Fmoc-Gly-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入3.04mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到  Fmoc-Gly-CTC Resin。结构图如下：

2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Gly-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取3.04mmol Fmoc-His(Trt)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入6.08mmol DIPEA，2.89mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-His(Trt)-Gly-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-His(Trt)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

H2N-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

H2N-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

Fmoc-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

H2N-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

H2N-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Gly-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

H2N-Gly-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

Fmoc-His(Trt)-Gly-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

H2N-His(Trt)-Gly-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Gly-His(Trt)-Gly-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

H2N-Gly-His(Trt)-Gly-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Gly-His(Trt)-Gly-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

H2N-Ser(tBu)-Gly-His(Trt)-Gly-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Val-Ser(tBu)-Gly-His(Trt)-Gly-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

H2N-Val-Ser(tBu)-Gly-His(Trt)-Gly-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

Fmoc-Gly-Val-Ser(tBu)-Gly-His(Trt)-Gly-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

H2N-Gly-Val-Ser(tBu)-Gly-His(Trt)-Gly-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

Fmoc-His(Trt)-Gly-Val-Ser(tBu)-Gly-His(Trt)-Gly-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-His(Trt)-Gly-Val-Ser(tBu)-Gly-His(Trt)-Gly-Gln(Trt)-His(Trt)-Gly-Val-His(Trt)-Gly-CTC Resin，结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly-COOH。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽等。

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