说到三氟乙酸,它可是在多肽的合成、纯化和检测过程中,发挥着重要作用。接下来小编将从这三个方面进行讲解,估计你就会明白为什么购买的多肽是三氟乙酸盐了。
多肽的合成阶段
在多肽合成的链增长阶段(缩合与脱保护),没有使用到三氟乙酸,不过通常在最后一步(切割步骤)使用到高浓度的三氟乙酸,以去除所有的侧链保护基团。
这里是第一次使用到了三氟乙酸,我们拿到了粗品里面肯定是含有一定比例三氟乙酸这种物质,后期没有去除的话,那么多肽里面就会含有三氟乙酸。
多肽的纯化阶段
现在比较常规的多肽纯化方法是 高效液相色谱制备方法(HPLC),其效率非常高,并能分离多肽杂质,获取目标结构的多肽。
通常我们在使用HPLC制备多肽时,使用的A、B流动相(也叫有机相、水相)都添加了0.1%三氟乙酸,例如A流动相为0.1%TFA/H2O,B流动相为0.1%TFA/ACN
这里时第二次使用到了三氟乙酸,也是为什么多肽是三氟乙酸盐的直接原因。用HPLC纯化多肽后,我们收集到了目标峰的溶液,其中大部分水,小部分是乙腈(ACN),当然还有0.1%的TFA。
多肽的冻干阶段
我们拿到上述HPLC制备后的多肽溶液,先用液氮或者-80摄氏度冰箱,将溶液的温度降至最低,然后放到冻干机上,最后我们就拿到了蓬松的粉末状固体的多肽啦。这是我们来分析下此时的多肽的主要成分。
从溶液到粉末状固体的过程中,我们去掉了几乎所有的水和乙腈,最终会残留
一些水份(通常在2%以内)、
乙腈(因为乙腈很容易冻干挥发,残留量极少)
三氟乙酸(三氟乙酸分子容易和肽段结构中的碱性基团结合,其比例主要取决于肽段碱性基团的个数和纯化的工艺,是一个未知数,这里是多肽是三氟乙酸的根本原因)
其它未分离开的杂质多肽分子(这个可以通过HPLC纯度来判断)
现在我们来总结下,多肽是用高浓度三氟乙酸切割,去掉保护基团,并用含0.1%三氟乙酸的流动相来纯化,最后冻干还会残留三氟乙酸。所以通常情况下,我们购买的多肽就是三氟乙酸盐的。
一般三氟乙酸盐的多肽不适合做细胞实验,毕竟三氟乙酸分子对细胞是有一定伤害的。不过不用担心,在多肽纯化阶段,我们可以再次纯化多肽,用醋酸或者盐酸 置换掉 三氟乙酸,可以大幅度减少三氟乙酸的残留量。以满足实验需求。