摘要: 本文拟构建一种模拟细胞外基质结构与功能的基因活化支架 (ECM-m-GAM), 并对其结构、机械强度和释放性能进行表征。首先制备细胞穿膜肽 TAT 修饰的脂质体基因载体 TAT-LPD, 然后将 TAT-LPD 与 RGD 修饰的透明质酸混合, 加入交联剂 MMPs 敏感肽 (HS-MMP-SH), 使透明质酸凝胶化, 在凝胶化过程中实现对TAT-LPD 的负载, 从而将细胞黏附因子 RGD、MMPs 敏感底物和高效的基因转染载体 TAT-LPD 有机地整合到 一个结构中, 完成 ECM-m-GAM 的构建。利用 PicoGreen 试剂盒考察 ECM-m-GAM 在不同释放介质中 DNA 的释放行为。研究结果表明: TAT-LPD 在透射电镜下呈球形, 平均粒径为 (263.0 ± 4.30) nm, 可被成功地包埋在ECM-m-GAM 中; ECM-m-GAM 具有典型的凝胶结构, 机械强度随着透明质酸用量的增加而增强, 透明质酸用量为 4%时其弹性模量约为 1 600 Pa, 适合支架植入和组织修复; DNA 从 ECM-m-GAM 中的释放呈现明显的 MMPs敏感性, 并且释放的 DNA 仍以纳米粒的形式存在, 能够转染大鼠骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 并表达绿色荧光, 为后续的细胞转染和组织修复研究奠定了基础。
随着医学技术的迅猛发展, 利用组织工程技术进行缺损组织和器官的修复与再生已成为一种极具潜力的治疗手段, 生长因子是组织工程中应用的重要的细胞营养物质, 具有诱导和刺激细胞增殖、维持细胞存活等多方面的生物功能。然而, 生长因子多为蛋白类药物, 其半衰期比较短, 在体内容易失去生物活性, 只能在短期内产生效果, 此外, 生长因子的价格昂贵, 治疗成本高。
近年来, 基因治疗技术的发展及其在组织工程领域的应用为这些问题的解决提供了新的策略。将编码有生长因子并具有转染能力的 DNA 融合于生物可降解材料中构建含 DNA 的生物支架, 即基因活化支架 (gene-activated matrix, GAM)[1]。将 GAM 直接植入到组织缺损区, 可在植入部位释放 DNA 并转染附近的细胞。一旦转染成功, 细胞将成为生物反应器, 持续表达并分泌基因所编码的生长因子, 达到对细胞分化和组织再生调控的目的[2, 3]。GAM 在结构上包含 DNA 复合物和支架材料两部分, 这两部分的功能决定了 GAM 的功能。目前, 关于 GAM 的研究热点主要集中于仿生支架的设计及如何实现高效的 DNA转染这两个方面。
细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 是体内细胞生长的微环境, 是由纤维蛋白和多糖组成的复杂的网架结构, 它通过黏附因子与细胞表面受体结合, 促使细胞在基质上附着, 细胞则通过自身释放的酶降解基质, 为自身的迁移和增殖创造空间, ECM 对维持细胞的生理活动具有重要的作用。支架作为承 载细胞附着、生长和增殖的微环境, 应最大程度地模拟 ECM 的功能。凝胶是组织工程中常用的支架形式, 其交联网络的多孔结构利于细胞的迁移及活性物质的传递, 可以很好地模拟 ECM 的网架结构。基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMPs) 属于细胞内的蛋白水解酶家族。在组织修复过程中, 细胞能够分泌 MMPs, 它几乎能降解 ECM 中的各种蛋白成分, 从而为细胞的迁移与增殖提供空间。RGD 肽是一类含有精氨酸−甘氨酸−天冬氨酸 (Arg-Gly-Asp) 的短肽, 存在于多种生物细胞外基质中, 能特异性识别细胞表面的整合素并与之结合, 是细胞在 ECM 中附着和迁移的识别部位。受此启发, Lutolf 等[4]用 MMPs敏感肽交联聚乙二醇 (PEG) 制备 PEG 凝胶, 再将RGD 连接到凝胶上构建细胞支架。该凝胶支架兼具细胞黏附因子 RGD 及 MMPs 敏感性。依靠 RGD 介导及 MMPs 的酶解作用, 人纤维母细胞能够吸附并侵入凝胶内部, 体内研究表明负载骨形成蛋白 BMP-2 的凝胶支架具有良好的骨修复作用。Kim 等[5]将 RGD修饰的透明质酸用 MMPs 敏感肽交联制备凝胶支架, 更好地仿生了ECM的功能, 因为透明质酸是ECM中的主要成分, 它存在于迁移细胞的周围, 能够抑制细胞间的黏附, 促进细胞迁移。Lei 等[6]考察了小鼠间充质干细胞在上述凝胶支架中的生长情况, 结果表明 MMPs 敏感性及 RGD 的存在有利于细胞在支架中的迁移、生长和增殖。
细胞穿膜肽 TAT (transcriptional activator protein) 具有高效的入胞能力, 能够迅速破坏内吞体膜, 逃 逸溶酶体。TAT 已经成功携带多种生物活性物质及 载体, 包括蛋白质、DNA、多肽、纳米粒和脂质体等进行细胞内传输, 是一种新型而高效的药物递送工具[7, 8]。利用 TAT 修饰非病毒载体可以实现高效的基因转染。Torchilin 等[9]用 TAT 修饰负载 DNA 的脂质体, 构建 TAT-liposome-DNA 复合物, 其对鼠 NIH/3T3成纤维母细胞和 H9C2 心肌细胞的转染效率显著高于未经 TAT 修饰的 DNA 脂质体。
本文率先提出构建一种新型的“细胞外基质仿生型基因活化支架”(ECM-mimicking-GAM, ECMm-GAM): 用 TAT 修饰脂质体作为高效的基因转染载体, 将其与 RGD 修饰的透明质酸混合, 加入交联剂MMPs 敏感肽 (HS-MMP-SH) 使透明质酸凝胶化, 得到脂质体/凝胶复合系统。从而将具有高效转染能力的 TAT 脂质体、细胞黏附因子 RGD 和对细胞分泌酶 MMPs 敏感的交联链整合到同一个结构 (透明质酸凝胶) 中, 完成 ECM-m-GAM 的构建。本文将优化并报道该支架的制备方法, 表征其表面形态和机械性能, 评价其对 DNA 复合物的负载及 MMPs 敏感性释放行为, 为细胞转染及组织修复研究奠定基础。
