穿膜肽在肿瘤靶向治疗中的应用

引言
在肿瘤的临床治疗中化疗和放疗是常见的两种手段。在传统的化疗中，常用的抗肿瘤药物因其细胞选择性差、不良反应强给患者带来了极大的痛苦。因此研发新型的具有靶向选择性的抗肿瘤药物显得极为迫切。
穿膜肽是由5~30个氨基酸残基组成的具有穿透细胞膜的药物载体。穿膜肽在穿透细胞膜的同时还可介导siRNA[1]、核酸[2-3]、小分子药物[4]、蛋白质或其他多肽[5-6]等进入细胞。相比其他载体而言，穿膜肽具有高效低毒等特点[7]。

1、 穿膜肽的分类
穿膜肽有多种多样的分类方式，但是根据多肽的物理化学性质，穿膜肽主要可以分为三类：阳离子、两亲性以及疏水性穿膜肽。
1.1 阳离子穿膜肽
阳离子穿膜肽是一些带有较高的正电荷和少数酸性氨基酸的多肽。第一条被发现的穿膜肽Tat（RKKKRRQRRR）是由Green等[8]从HIV-1蛋白中分离出来的，属于典型的阳离子穿膜肽。阳离子在肿瘤治疗研究中，将传统的抗肿瘤药物与具有靶向性的穿膜肽载药系统连接，用了穿膜肽衍生物的靶向选择性，既降低了传统抗肿瘤药物的不良反应，又提高了药物的利用率。对于治疗肿瘤疾病和降低患者痛苦，都有极大的现实意义。因此，肿瘤靶向穿膜肽衍生物的设计和功能研究越来越受到重视，他在药物递送系统中可能扮演的重要角色也为研究者们所看好。穿膜肽的正电荷一般由Arg和Lys来提供。有学者对多聚精氨酸进行研究发现，八聚精氨酸是能被细胞摄取的最短的序列，并随着精氨酸个数的增加，细胞摄取效率显著增强[9]。相比较而言，多聚赖氨酸的穿膜能力要弱很多[9]。对此，学者们提出，阳离子多肽至少带有八个正电荷才能有效地穿透细胞膜。

阳离子穿膜肽被认为是进入细胞而不会影响细胞生理功能的特洛伊木马载体[8]。研究表明，阳离子穿膜肽会引起广泛的不良反应，包括破坏细胞膜稳定性，甚至导致细胞死亡。典型的阳离子穿膜肽有R9[9]、Tat[10]、Protamine1、Penetratin[11]。

1.2 两亲性穿膜肽

两亲性穿膜肽的两亲性特征主要表现在其一级和二级结构中。一级结构两亲性穿膜肽具有亲水性的N端和疏水性的C端[12]。研究较多的一级结构两亲性穿膜肽主要是将靶向细胞膜的疏水性区域与核定位序列NLS通过一个连接子WSQ共价连接得到的[13]。例如，MPG[（GLAFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV）和PEP-1[15]均在来源于病毒SV40的核定位序列（PKKRKV）的基础上合成。MPG的疏水区来源于HIV的gp41，而Pep-1与一段富含色氨酸的序列相连，均与细胞膜有很强的亲和性。还有一些一级结构两亲性穿膜肽主要从天然蛋白质中分离出来，例如：pVEC[16]、ARF(1-22)[17]、BPrPr（1-28）[18]。而二级结构两亲性穿膜肽的两亲性由分子特定的构象产生。二级两亲性α-螺旋穿膜肽的一面有很强的疏水性，另一面可能是阳离子的、阴离子的、或极性的氨基酸。β-折叠的两亲性穿膜肽的结构基础一面是疏水性的，由亲水性氨基酸组成的另一面则暴露在溶剂中，如vT5（DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD）[19]。

两亲性穿膜肽中富含脯氨酸的一类穿膜肽引起了学者们的关注。他们都具有脯氨酸吡咯烷结构[20]，但来源和序列极具多样性。通过圆二色谱和透色电子显微镜的进一步研究发现，这类穿膜肽都具有很强的自组装能力。

1.3 疏水性穿膜肽

只含有非极性氨基酸的多肽被划为疏水性穿膜肽，包括嵌合肽、棕榈酰化多肽[21]、烯化多肽[22]。到目前为止，发现的疏水性穿膜肽有:Kaposi纤维原细胞生长因子（AAVALLPAVLLALLAP）、来源于β3整合素的信号序列（VTVLALGALAGVGVG）[23]等。穿膜肽作为一种生物载体，具有较大的应用前景，与其他的生物大分子材料相比，具有其独特之处。首先，穿膜肽不仅可以转导多肽和蛋白质，也可以将相连的DNA、噬菌体、脂质体等多种不同大小的其他物质导入细胞；其次，穿膜肽导入的细胞谱广泛，几乎能将所携带的外源分子
导入所有的哺乳动物细胞中；第三，穿膜肽转导迅速、转导效率高，几乎可以达到100%。

2 穿膜肽在肿瘤靶向治疗中的应用

抗肿瘤药物由于不能很好地区分正常细胞和肿瘤细胞，因而在临床治疗中，表现出较大的不良反应。近几年，靶向肿瘤细胞或肿瘤血管组织药物的研发受到了广泛关注，其中包括对穿膜肽的靶向研究。一般穿膜肽在穿透细胞过程中不具备识别能力，这是穿膜肽用于临床面临的最大挑战。为了解决这一难题，科学家们通过对穿膜肽进行设计和改造，使这些穿膜肽衍生物能够靶向肿瘤细胞表面特异表达的受体，肿瘤细胞内过表达的酶或肿瘤组织特殊的微环境。上述转运系统到达靶点前，通过掩盖穿膜肽的穿膜活性，避免穿膜肽在正常组织的非特异性摄取；到达靶点后，穿膜肽完全暴露出来，携带药物进入细胞，使药物被有效地摄取，提高药物的靶向治疗作用。

理论上，肿瘤细胞在肿瘤治疗和成像上是很好的靶标，但由于传统的化疗药物都是靶向整体的肿瘤细胞，而肿瘤组织的血液灌注比较弱、间质压力较高并且肿瘤组织的血管异常，因此化疗药物很难大量地集中在肿瘤组织中[24-25]，达不到有效的治疗浓度。肿瘤细胞及组织也有很多区别于正常细胞的生理特征，例如，某些肿瘤细胞相较于正常细胞有过表达的受体、肿瘤组织的微酸环境、肿瘤组织中特有的基质金属蛋白酶。研究者们利用这些生理特征设计了一系列的穿膜肽药物转运系统，携带传统的抗肿瘤药物，靶向地进入肿瘤组织，抑制肿瘤细胞的生长。

2.1 利用酸敏感穿膜肽修饰抗肿瘤药物提高靶向性

肿瘤组织由于代谢快、供氧不足等原因，细胞通过糖酵解提供能量产生大量乳酸，且肿瘤血管不能及时清除，最终导致肿瘤组织微环境pH值为5.7~7.2，明显低于正常组织的pH7.4[26]。这种酸性微环境是提高抗肿瘤药物选择性的一个有效靶点。

2.1.1 组氨酸 组氨酸是一种具有缓冲能力的氨基酸，被大量用于酸敏感药物转运系统的研究。组氨酸咪唑基团的pKa约为6.5，所以在酸性肿瘤微环境中能够质子化带正电荷，而在正常生理环境下不带电荷。考虑到组氨酸的这一特点，研究者们设计了一系列具有穿透或裂解细胞膜的酸敏感多肽。Zhang等[27]研究了酸敏感穿膜肽TH与荧光素标记后，在不同酸性条件下的穿膜活性以及TH与喜树碱连接物的抗肿瘤活性。研究结果表明，TH以及与喜树碱连接物都表现出很好的酸依赖活性，并且TH的体外和体内毒性都明显降低。如此，既增强喜树碱的水溶性，提高喜树碱的抗癌活性，又降低了其对正常组织的毒性，降低临床应用中对患者的不良反应。Jiang等[28]用酸敏感穿膜肽R6H4与透明质酸形成双功能脂质体（HAR6H4-L），以肿瘤组织中的透明质酸受体和酸性微环境为靶点，研究该脂质体与抗肿瘤药物紫杉醇连接（PTX/HA-R6H4-L）后在不同条件下的抗肿瘤活性。实验结果显示，PTX/HA-R6H4-L在pH6.4对肝癌细胞的毒性明显强于pH7.4。

2.1.2 腙键 腙键是一个酸敏感的连接子且是比较理想的共价键连接体。腙键与传统的酯键和酰胺键不同，腙键对酸性比较敏感、键的断裂不需要溶酶体酶。相对于亚胺键来说，腙键具有更加稳定的结构，可存在于中性和碱性环境。只有在酸性环境和高温催化条件下，腙键的转胺效率才
会显著提高。在生理pH7.4条件下，腙键非常稳定，当pH降到5~6时，腙键迅速裂解释放出药物。Sawant等[29]将磷脂酰乙醇胺和PEG通过二硫键连接，得到mPEG-HZ-PE，在此连接物中引入了一个酸敏感的腙键，再将得到的mPEG-HZ-PE用穿膜肽TAT或生物素修饰，得到一个纳米载体。在生理pH条件下，纳米载体表面的生物素或TAT被PEG长链（酸敏感PEG2000-PE或PEG5000-PE）保护起来，在pH7.5~8.0条件下，被TAT修饰的纳米载体几乎不会穿过NIH/3T3和U-87细胞膜，被细胞内化。然而，在pH5.0~6.0条件下孵育15~30 min时，纳米载体中的腙键断裂，PEG丢失，裸露出阳离子穿膜肽TAT，该纳米载体有效地被细胞内化。将抗肿瘤药物与该载体连接，就能靶向地进入肿瘤组织，从而达到靶向治愈癌症的目的。以上研究结果表明，酸敏感穿膜肽与传统的抗肿瘤药物连接，不仅可以提高其水溶性，降低其毒性，还能增加其肿瘤组织渗透性，避免产生耐药性，提高其临床应用。

2.2 利用靶向穿膜肽修饰抗肿瘤药物提高抗肿瘤药物的选择性

    肿瘤穿透归巢肽（cell-penetrating homingpeptides, CPHPs）与经典的穿膜肽类似，具有穿膜活性，在穿膜的过程中具有细胞特异性[30]。CPHPs与受体识别并结合，通过内吞的方式将所载药物运输到靶细胞中。RGD能够特异性的识别在肿瘤侵袭过程中表达上调的αv整合素，RGD具有多种形式。例如：RGD-4C，iRGD和cRGD等。将RGD与诱导凋亡多肽或抗肿瘤药物连接，应用于关节炎和多种癌症的治疗。iRGD（Cys-ArgGly-Asp-Lys/Arg-Gly-Pro-Asp/Glu-Cys[CRGDK/RGPD/EC]）据报道能够增强多血管及组织的特异性，且这种增加具有肿瘤特异性和神经毡蛋白（NRP-1）依赖性。由于iRGD具有肿瘤靶向性和肿瘤穿透性，而某些肿瘤会过度表达αv蛋白受体和NRP-1，Yu等[31]将iRGD作为靶向配体，空间稳定脂质体为转运系统（SSL），携带阿霉素形成了一个iRGD修饰的脂质体药物转运系统（iRGDSSL-DOX），测定其对αv蛋白受体和NRP-1过度表达的B16-F10细胞构成了裸鼠肿瘤细胞模型的抑瘤率。实验结果表明，iRGD-SSL-DOX与对照组SSL-DOX相较，明显抑制B16-F10肿瘤细胞的生长。且从小动物成像结果来看，前者高度集中在肿瘤区域，提高了阿霉素的安全性以及治疗效果。上述具有细胞特异性的CPHPs还有TCP-1、CAP等等。

除了上述CPHPs，还有一类与其相似的靶向肽：肿瘤归巢肽（homing peptides, HPs）。肿瘤归巢肽与CPHPs类似，同样具有识别肿瘤细胞或组织中受体的功能，但没有穿膜作用。因此，研究者们将肿瘤归巢肽与经典的穿膜肽相连，形成靶向转运系统。Mäe等[32]研究了线性乳腺肿瘤归巢肽CREKA与穿膜肽pVEC相连形成的嵌合肽与烷化剂苯丁酸氮芥对MDA-MB-231肿瘤细胞的杀伤作用。实验结果表明，该共轭物的体外抗肿瘤效果明显强于苯丁酸氮芥单独用药。说明CREKApVEC是合适的细胞内靶向转运体。

大量研究结果表明，CPHPs和HPs能够识别组织中特异性的生物标志，进入特异的组织或器官中。这些归巢肽不仅可以提高细胞摄取率且能将药物分子、成像制剂、纳米粒子、寡核苷酸和脂质体靶向转运到各种组织包括肿瘤。

2.3 穿膜肽基于肿瘤细胞表面特异性受体实现靶向转运

肿瘤细胞表面会表达大量的受体，一些过表达的受体在肿瘤的生长、迁移、侵袭和转移中介导着重要的生理功能。研究者们利用肿瘤组织中有别于正常组织中的受体设计一系列抗肿瘤药物转运系统，使抗肿瘤药物富集在病灶，达到高效治疗肿瘤的目的。

2.3.1 叶酸受体 叶酸对细胞表面的叶酸受体有高度特异性和亲和性。叶酸受体是一种糖基化磷脂酰肌醇连接的膜糖蛋白，在90%卵巢癌和上皮细胞癌中选择性的过度表达[33]，包括HeLa细胞。Kang等[34]研究叶酸和穿膜肽PEP-1构成的双配体修饰脂质体（FP-Lipo）在HeLa细胞和叶酸受体表达较少的HacaT细胞的穿膜肽能力。在研究中同时合成了叶酸修饰的脂质体（F-Lipo）、Pep-1修饰的脂质体（P-Lipo）。研究结果表明，P-Lipo在这两种细胞中没有选择性。而F-Lipo在HeLa细胞中荧光强度比HacaT细胞中强，具有一定的细胞选择性，但细胞穿透能力较P-Lipo弱。FP-Lipo在HeLa细胞中的荧光强度是HacaT中的3倍， FP-Lipo与其他两种脂质体比较，具有更强的穿膜能力和靶向性。利用此种转运系统，就能将抗肿瘤药物转运到肿瘤细胞中，高效、选择性的杀死肿瘤细胞，降低药物的不良反应。

2.3.2 ErBb2 ErBb2是一种表皮生长因子受体，在25%~35%乳腺癌、卵巢癌和结肠癌中过度表达。Tan等[35]将由Tat衍生的穿膜肽与抗HER-2/神经鞘肽结合，形成AHNP。为了设计一个能够将药物特异性转运到ErBb2过度表达的肿瘤细胞的多肽载体，他们研究了具有非选择性穿膜活性的TAT精氨酸残基部分P3（YGRKKRRQR）与AHNP形成的多肽载体与STAT3抑制肽的络合物对乳腺癌的抑制效果。通过免疫组织染色研究证明，STAT3能够激活50%的乳腺癌并且预后不良，STAT3抑制肽（STAT3BP）能够抑制STAT3转录因子的活性。将STAT3BP与AHNP结合形成的络合物能够将STAT3BP特异性转运到ErBb2过度表达的乳腺癌细胞中，达到破坏STAT3活性、诱导细胞凋亡和抑制体内肿瘤生长的作用，与此同时，STAT3BP的活性并没因与AHNP结合而受到影响。该络合物表现出更强的抑制ErBb2过度表达的435.eB肿瘤细胞，增大其凋亡比例。而ErBb2表达相对较少的MDAMB-435对药物的敏感度则较差。

2.4 利用肿瘤组织特有的基质金属蛋白酶实现靶向传送

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）是一组结构上具有极大同源性，能够降解细胞外基质（ECM）蛋白的内肽酶的总称。因含有金属离子（锌、钙）而得名。肿瘤分泌MMPs降解ECM，破坏周围间质成分和重整细胞之间的黏附关系，促进新生血管的生成，进而肿瘤细胞便沿着破坏的ECM向周围组织浸润、侵袭和转移。由于基质金属蛋白酶家族中的MMP-2和（或）MMP-9已被证实在多种恶性肿瘤中高表达，在正常组织中表达微弱，且其表达与肿瘤细胞的转移
潜力相关，成为设计靶向抗肿瘤药物的靶点。

2004年，第一个利用穿膜肽设计的能够被激活的靶向转运系统被报道。Jiang等[36]用可以被MMP-2切断的PLGLAG将带正电荷的穿膜肽（九聚精氨酸）和带负电荷的八聚谷氨酸连接形成了一个嵌合体。这个嵌合体中，九聚精氨酸的正电荷与八聚谷氨酸的负电荷通过点和相互作用力形成发卡结构。以6 μM的浓度给药，发现由于循环系统中MMP-2的浓度较低，连接子PLGLAG没有发生断裂。九聚精氨酸的正电荷被八聚谷氨酸的负电荷屏蔽，阳离子穿膜肽不能与血管中带负电荷的细胞结合，避免正常组织中的非特异性结合。而在肿瘤组织周围，由于肿瘤细胞的分泌，MMP-2的浓度明显增加。该嵌合体的连接子被切断，带正电荷和负电荷的离子部分游离出来，穿膜肽的穿膜能力得以恢复，进入肿瘤细胞中。利用这种方法，穿膜肽就能被肿瘤细胞选择性的摄取，由于穿膜肽携带的药物都共价连接在穿膜肽上，因此可以通过嵌合体的浓度来调节给药浓度，达到靶向治疗肿瘤的目的。

3 穿膜肽的临床应用

穿膜肽在携带药物及其他功能性分子时，由于具有高效低毒特性，受到广大科学家及医务工作者的广泛关注，更多地投入到穿膜肽的研究中，促使穿膜肽从基础研究发展到了临床，造福人类。

西仑吉肽[30]是一种靶向αvβ3和αvβ5整合素的肿瘤血管生成抑制多肽药物，是环状RGD五肽盐，也是第一个进入临床实验的CPHP。在临床Ⅰ期和Ⅱ期试验中，西仑吉肽与放射疗法和替莫唑胺联合应用于恶性胶质瘤中的晚期实体瘤、复发性恶性胶质瘤和难以治愈的脑瘤患者。研究结果表明，西仑吉肽能够将37%的复发性恶性胶质瘤患者的生命延长1年，22%的患者延长2年；与其他的药物相比，效果较好。

由MolMed SpA公司研制的NGR-hTNF是将N G R多 肽 （C N G R C） 与 人 肿 瘤 坏 死 因 子（TNF-α）的N末端共轭结合所得，能选择性地识别氨基肽酶N（CD13）特异性亚型，而CD13仅在血管生成组织中表达，在正常上皮组织中未见。因此，该药NGR多肽部分通过选择性靶向血管发生作用，TNF则在靶点释放，破坏肿瘤的血流供应，从而使肿瘤缩小。多项Ⅰ、Ⅱ期临床试验均显示：当NGR-hTNF单独或与化疗药物联用于恶性胸膜间皮瘤、直肠癌、肝癌以及非小细胞肺癌等多种进展期或转移性实体瘤时，均表现出良好抗肿瘤活性，且患者对其有良好的耐受性。

4 结语
穿膜肽由于能够携带小分子药物、核酸、多肽等进入细胞，近年来在药学及治疗学领域受到了广泛的关注。但由于缺乏细胞选择性、稳定性差、生物利用度低而限制了穿膜肽的临床应用。科研学者们利用非天然氨基酸提高其稳定性，用透明质酸等保护穿膜肽在到达靶点前被降解提高其生物利用度，根据肿瘤特异性对穿膜肽加以修饰；将靶向肽与经典的穿膜肽相连，赋予穿膜肽肿瘤靶向性，大大提高了穿膜肽在肿瘤治疗方面的应用。目前穿膜肽及其衍生物在临床上的应用还很少，因此，降低穿膜肽这种载体的不良反应，提高其体内稳定性，将会有很好的发展前景。