摘要:
本文设计可活化细胞穿膜肽 (activatable cell-penetrating peptide, ACPP), 对合成的 ACPP 进行酶解研究。ACPP 由 3 部分连接而成, 寡聚阴离子序列肽-基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase, MMP) 的底物肽-寡聚阳离子序列肽。采用反相高效液相色谱 (reversed-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC) 监测 37 ℃条件下 IV 型胶原酶 (含 MMP-2 和 MMP-9) 对 ACPP 的酶解过程。收集酶解成分进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (matrix assisted laser desorption ionization orthogonal time of flight mass spectrometry, MALDIO-TOF-MS) 检测, 比对推测酶解碎片的序列。结果表明, ACPP 可被 IV 型胶原酶裂解, 释放出寡聚阳离子序列肽, 即细胞穿膜肽 (cell-penetrating peptide, CPP), ACPP 裂解一半的时间约为 4 h。酶解发生于目标位点, 但不排除 ACPP 裂解后肽段的再次断裂。
在研究中发现越来越多的肽类、蛋白类及核酸类等生物活性物质具有很好的药理作用。绝大多数的生物大分子因其分子的大小、所带电荷、极性以及细胞膜的屏障作用不能通过被动扩散穿透生物膜, 细胞对于这类分子的摄取非常少。因此, 缺乏穿透细胞膜并到达细胞内靶点的能力是肽类、蛋白类及核酸类药物发展和使用的一个严重的障碍[1]。
将难进入细胞的生物活性分子与细胞穿膜肽(CPP) 通过化学连接或物理集合的形式, 以非侵袭性的方式穿透细胞膜, 克服细胞对亲水生物活性物质摄取太少的难题, 是目前药物运输系统的重要研究方向[1−4]。这种由多肽介导的生物活性分子的运输, 具有效率高、毒性低, 而且多肽主链具有可修饰性, 在很多方面都优于传统的方法。然而, CPP 缺乏组织和细胞的特异性[3], 作为药物载体的应用过于复和难于控制, 存在靶细胞摄取效率低及体内吸收、分布、生物利用度和毒性等方面问题, 严重限制了其作为药物运输工具的应用。针对这个难题, 可活化的细胞穿膜肽 (activatable CPP, ACPP) 应运而生[5]。利用 ACPP 选择性地将生物大分子运送到癌细胞是一种全新的药物运输思路。
基质金属蛋白酶家族中的 MMP-2 和/或 MMP-9已被证实在多种恶性肿瘤中高表达, 包括胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌和前列腺癌等, 但在正常组织中表达微弱。MMP-2 和 MMP-9 的表达与肿瘤细胞的转移潜力相关。在侵袭性肿瘤细胞中 MMP-2 和 MMP-9 的表达水平较高, 能降解 IV型胶原 (血管基底膜的主要成分、转移的主要生理屏障), 与肿瘤的血管发生、肿瘤生长和转移相关[6, 7]。基于以上考虑, 本研究设计了以MMP-2和MMP-9为靶酶的ACPP, 采用RP-HPLC和MALDIO-TOF-MS, 研究了 ACPP 的酶解反应行为并对酶解产物的多肽片段进行序列推测, 判断酶解位点。
材料与方法
材料与仪器 乙腈 (色谱纯, 天津西华特种试剂厂)、IV 型胶原酶 (Sigma, USA)。高效液相色谱仪 (Agilent 1100 Series, USA)、Diamonsil C18 色谱柱(250.0 mm × 4.6 mm, 5 μm)、MALDI-TOF 质谱仪(Waters MALDI Micro MX, USA)。ACPP 的设计与合成 ACPP 的序列由 3 部分组成, 如图 1 所示的 A 段、B 段和 C 段, 序列为E-E-E-E-E-X-P-L-G-L-A-G-R-R-R-R-R-R-X-K-C, 分子式 C106H188O32N40S, 相对分子质量为 2 566.94。
A 段序列 R-R-R-R-R-R-X-K-C 为 ACPP 的活性中心 (CPP 区), 5 个精氨酸组成的序列带正电荷, 具有细胞膜穿透功能[1]。B 段序列 P-L-G-L-A-G 为MMP-2 和 MMP-9 的识别位点, 并可被 IV 型胶原酶(主要为 MMP-2 和 MMP-9) 特异性断裂[4−10]。C 段序列 E-E-E-E-E-X 带负电荷, C 段的功能为通过中和 A段的正电荷来封闭 A 段的细胞膜穿透活性。
带负电荷的 C 段序列屏蔽了 A 段序列的正电荷, 由寡聚精氨酸构成的 CPP 的活性被具有负电荷的氨基酸构成的抑制性多肽区掩盖, 暂时失去细胞膜穿透功能, 当带正电的寡聚阳离子区和带负电的寡聚阴离子区之间的连接区域 (P-L-G-L-A-G) 被蛋白酶裂解时, 释放出 CPP 从而发挥功能。这种复合细胞穿膜肽称为 可活 化细胞 穿膜 肽 (activatable cellpenetrating peptide, ACPP)。
ACPP。采用常规 Fmoc 固相合成法逐步连接单氨基酸直到形成目标序列, 用茚三酮法验证每一步氨基酸缩合与脱保护的正确性。粗肽经RP-HPLC纯化。MALDI-TOF-MS检测验证合成多肽分子量的正确性, 以确保一级结构序列正确。
酶解反应分析 将 ACPP 粉末 0.5 mg 溶于蒸馏水 500 μL中, 得到质量浓度为 1.00 mg·mL−1的 ACPP储备液。用蒸馏水将储备液分别稀释为 0.571、0.612、0.714、0.833 和 1.00 mg·mL−1 的 ACPP 水溶液。ACPP储备液与 IV 型胶原酶储备液混合, 二者终浓度分别为 0.571 和 2.2 mg·mL−1 (浓度比为 0.26), 在 37 ℃水浴条件下进行酶解反应。在反应过程对酶解体系取样, 进行 HPLC 分析。流动相: A-水 (0.1% TFA); B-乙腈 (0.1% TFA); 程序: 在 0～40 min 内 B 由 5%至70%; 流速: 1 mL·min−1; 紫外检测参数: 214 nm; 进样量: 20 μL。收集 HPLC 分离的成分, 冻干, 进行MALDI-TOF-MS 检测[11]。解析 HPLC 分离组分的MALDI-TOF-MS 结果。采用人工比对的方法对 ACPP的酶解产物多肽片段进行序列推测[12, 13]。
结果与讨论
1 ACPP 的合成与验证
ACPP 合成后, 采用 MALDI-TOF-MS 检测验证合成多肽分子量的正确性, 结果如图 2。m/z 实验值为2 566.49 (2 567.49 为[M+H]+峰) 与理论值2 566.94相符, 说明合成的多肽正确。经 HPLC 检测 ACPP 纯度>99%。
2 酶解反应
HPLC 检测 ACPP 的峰位和酶解反应后的图谱变化情况, 不同浓度的 ACPP 溶液都在 14.8 min 左右处有吸收峰 (图 3A)。峰高和峰面随 ACPP 溶 液浓度的升高而增大, 峰面积与 ACPP 浓度呈线性关系 (图 4), MALDI-TOF-MS 检测相对分子质量为2 567.24 [M+H]+。可以定 14.8 min 的峰即为 HPLC实验条件下 ACPP 的特征吸收峰。随着酶解时间的延长, 出现降解产物的峰 (图 3B), ACPP 的峰面积逐渐减少 (图 5)。37 ℃时, ACPP 降解一半的时间 (T1/2) 约为 4 h。
分别收集 TR为7.9, 12.3 和15.1 min 的3 个峰, 冻干, 进行 MALDI-TOF-MS 检测。通过 MALDI-TOFMS 解析及序列推测, 在 TR为 7.9 min 的峰中有序列为 G-R-R-R-R-R-R 多肽片段的[M+Na]+峰 (m/z 理论值为 1 012.27, 实验值为 1 012.54); G-R-R-R-R-R 多肽片段的[M+Na]+峰 (m/z 理论值为 856.07, 实验值为 856.49)。在 TR 为 12.3 min 的峰中有序列为 P-LG-L-A-G-R-R-R-R的多肽片段的[M+H]+峰 (m/z理论值为 1 151.50, 实验值为 1 150.67); E-E-E-E-E-X-P 多肽片段的 [M+H]+和 [M+Na]+峰 (m/z 理论值为873.98, 实验值为 873.49); E-E-E-E-E-X-P-L 多肽片段的[M+K]+峰 (m/z 理论值为 987.15, 实验值为986.55); E-E-E-E-X-P-L-G-L-A 多肽片段的[M+K]+峰(m/z 理论值为 1 099.35, 实验值为 1 099.69)。在 TR为 15.1 min 的峰中有序列为E-E-E-E-E-X-P-L-G 多肽片段的[M+Na]+峰 (m/z 理论值为1 044.22, 实验值为1 043.6)。
IV型胶原酶的主要成分为MMP-2和MMP-9[7−11], 有文献报道可以特异性断裂 P-L-G-L-A-G 序列[8−10]或其类似序列[8−11]。IV 型胶原酶有效地裂解了 ACPP, 酶解成分中含寡聚精氨酸序列可以发挥 CPP 的细胞穿透功能 (内容另行发表)。该酶解反应除了目标位点的裂解外, 其他位点的裂解片段同时存在, 不排除是最初酶解多肽片段再断裂的结果; IV 型胶原酶成分的多样性也是造成分解位点较多的原因之一; 另外 ACPP 降解一半的时间 (T1/2) 约为 4 h, 进行酶解产物分析是反应体系进行 23 h 后收集的分解产物峰, 反应时间过长也是造成分解位点较多的另一原因, 但只要 B 段序列断裂, 释放出 CPP (A 段), 即可发挥CPP 的细胞穿透功能。
