多肽AFC标记，全称多肽7-氨基-4-三氟甲基香豆素标记（Peptide 7-Amino-4-Trifluoromethylcoumarin Labeling），是一种将荧光分子“AFC”通过化学共价键连接到多肽特定位点（通常是C端或侧链）的修饰技术。其核心目的是为多肽赋予荧光检测特性，使其成为可追踪、可定量的“荧光探针”，广泛用于生物医学研究与药物开发。
AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素）是标记的核心荧光基团，具备两大关键优势：
光学特性优异：激发波长约390-400 nm，发射波长约510-520 nm，荧光强度高、光稳定性强，且背景荧光低（三氟甲基基团减少非特异性发光）；
反应活性适配：AFC分子通常以“活性酯”形式（如AFC-COOH、AFC-NHS）存在，可与多肽的氨基（-NH2）或羧基（-COOH）发生酰胺化反应，形成稳定的共价键，不影响多肽的生物活性。
多肽AFC标记的核心是特异性共价结合，典型流程如下：
多肽预处理：纯化目标多肽，确保其末端（如C端羧基）或侧链（如赖氨酸的ε-氨基）具备反应活性；
AFC活性酯制备：将AFC与活化试剂（如NHS、DCC）反应，生成高活性的AFC-NHS酯（避免自身聚合，提高标记效率）；
偶联反应：在温和缓冲体系（如PBS，pH 7.2-8.0）中，AFC活性酯与多肽的氨基/羧基反应，形成酰胺键，完成标记；
纯化分离：通过高效液相色谱（HPLC）去除未反应的游离AFC和副产物，获得高纯度的AFC标记多肽。
由于标记后多肽仍保留生物活性，且荧光信号可实时检测，AFC标记技术主要用于：
酶活性检测：将AFC标记在多肽底物的特异性位点（如蛋白酶识别序列），当酶切割多肽时，AFC被释放并发出强荧光，通过荧光强度变化定量酶活性（如凝血酶、基质金属蛋白酶MMPs的检测）；
受体-配体结合分析：AFC标记的多肽配体与细胞表面受体结合后，可通过荧光成像追踪结合过程、定量结合亲和力；
药物筛选：针对酶或受体的药物候选分子，可通过AFC标记多肽的荧光变化，高通量筛选抑制剂/激动剂的活性；
细胞内追踪：AFC标记的多肽进入细胞后，可通过荧光显微镜观察其在细胞内的分布、转运及代谢过程。
荧光信号强、背景低，检测灵敏度高（可达到nM-pM级别）；
标记反应温和，不破坏多肽的空间结构和生物活性；
AFC分子小（分子量约239 Da），对多肽与靶点的结合干扰小；
荧光特性稳定，适合长期监测和高通量实验。
标记位点需避开多肽的活性中心（如受体结合位点、酶切位点），否则会影响生物功能；
反应体系需严格控制pH和温度，避免AFC活性酯水解失效；
游离AFC需彻底纯化去除，否则会导致背景荧光偏高，影响检测准确性。
