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LAG-3是一种I型跨膜蛋白，主要表达在活化的T细胞和自然杀伤细胞上，由四个高度与CD4同源的细胞外免疫球蛋白（Ig）样结构域（D1-D4）组成。
LAG-3被确定为继CTLA-4和PD-1之后的第三个具有抗阻抗体的临床靶向免疫检查点。
LAG-3和PD-1在可移植肿瘤模型的肿瘤浸润淋巴细胞上被发现共表达，单独使用LAG-3抗体或与PD-1阻断剂联合使用可以在小鼠肿瘤模型中减少恶性癌细胞的生长并促进肿瘤清除。

在这项研究中，通过使用噬菌体展示技术，首次开发出一种高亲和力的环肽C25，其能特异性地结合到LAG-3上。进一步的体外和体内实验表明，C25能够有效阻断LAG-3信号通路并取得显著的抗肿瘤效果。
在本研究中，通过噬菌体展示技术鉴定出一种对人LAG-3蛋白具有高亲和力的环肽C25。结果表明，通过微量热泳动（MST）测定C25与人LAG-3蛋白的亲和力Kd值为0.66μmol/L，通过表面等离子共振（SPR）测定为0.215μmol/L，这表明C25能够有效结合LAG-3。除了与LAG-3的有效相互作用外，确定该分子在LAG-3与配体结合中的阻断效率也至关重要。因此，文章通过基于细胞的阻断实验测定了C25的阻断能力，发现C25能够以剂量依赖的方式阻断HLA-DR与LAG-3的结合。此外，当C25的浓度为100μmol/L时，阻断率达到了60%，这表明C25能够有效阻断LAG-3/HLA-DR蛋白质相互作用。LAG-3蛋白质由四个Ig样的细胞外结构域D1-D4组成。MHC-II通过LAG-3蛋白质的D1结构域与LAG-3相互作用。文章的研究发现C25能够阻断LAG-3与MHC-II的结合，因此我们推测C25可能与LAG-3的D1区域结合，占据MHC-II的关键位点，从而阻止LAG-3与MHC-II的结合。

使用免疫检查点抑制剂进行肿瘤免疫治疗的临床疗效取决于肿瘤浸润CD8+T细胞的激活和扩增。LAG-3作为T细胞的负调节因子，对CD8+T细胞具有直接抑制作用。LAG-3在未激活的CD8+T细胞上的表达水平较低，但在肿瘤浸润的CD8+T细胞中则过度表达，例如在肝细胞癌、肾细胞癌和其他实体瘤中。在自身耐受模型中，阻断LAG-3可增强CD8+T细胞的效应功能，并释放更多的IFN-γ。用LAG-3抗体治疗黑色素瘤肿瘤模型可导致CD8+IFN-γ产生细胞增加，肿瘤生长减缓。在文章的研究中，用C25肽治疗CT26异种移植小鼠模型后，肿瘤浸润的CD8+T细胞比例增加，脾脏和引流淋巴结中CD8+IFN-γ+T细胞的比例也显著增加。在B16-OVA异种移植小鼠模型中，用C25肽治疗后肿瘤浸润的CD8+T细胞比例增加。文章用OVA257-264肽体外刺激T细胞，该肽能够引起肽特异性抗原T细胞反应，发现脾脏、引流淋巴结和肿瘤中IFN-γ+CD8+T细胞的比例也显著增加。基于上述结果，C25治疗能够重新激活CD8+T细胞。

MHC-II是CD4和LAG-3的共同配体，LAG-3与MHC-II的相互作用能够负向调节CD4+T细胞的扩增并抑制细胞因子反应。

本研究通过噬菌体展示生物淘选技术开发了一种新型环肽C25，其可靶向LAG-3。C25肽在体外与LAG-3蛋白具有高亲和力结合，并能够阻止LAG-3与其配体HLA-DR的结合。体内实验表明，CD8+T细胞被激活，调节性T细胞（Tregs）减少，提示其具有抗肿瘤免疫活性。因此，文章的研究结果为癌症免疫治疗提供了针对LAG-3的新型候选肽和策略。

二硫键广泛存在与蛋白结构中，对稳定蛋白结构具有非常重要的意义，二硫键一般是通过序列中的2个Cys的巯基，经氧化形成。
 

形成二硫键的方法很多：空气氧化法，DMSO氧化法，过氧化氢氧化法等。
 

二硫键的合成过程，  可以通过Ellman检测以及HPLC检测方法对其反应进程进行监测。  
   

如果多肽中只含有1对Cys，那二硫键的形成是简单的。多肽经固相或液相合成，然后在pH8-9的溶液中进行氧化。      
 

当需要形成2对或2对以上的二硫键时，合成过程则相对复杂。尽管二硫键的形成通常是在合成方案的最后阶段完成，但有时引入预先形成的二硫化物是有利于连合或延长肽链的。通常采用的巯基保护基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多种基团。我们分别列出两种以2-Cl树脂和Rink树脂为载体合成的多肽上多对二硫键形成路线：
 

二硫键反应条件选择    
 

 二硫键即为蛋白质或多肽分子中两个不同位点Cys的巯基（-SH）被氧化形成的S-S共价键。 一条肽链上不同位置的氨基酸之间形成的二硫键，可以将肽链折叠成特定的空间结构。多肽分 子通常分子量较大，空间结构复杂，结构中形成二硫键时要求两个半胱氨酸在空间距离上接近。 此外，多肽结构中还原态的巯基化学性质活泼，容易发生其他的副反应，而且肽链上其他侧链 也可能会发生一系列修饰，因此，肽链进行修饰所选取的氧化剂和氧化条件是反应的关键因素， 反应机理也比较复杂，既可能是自由基反应，也可能是离子反应。      

反应条件有多种选择，比如空气氧化，DMSO氧化等温和的氧化过程，也可以采用H2O2，I2， 汞盐等激烈的反应条件。
 

空气氧化法： 空气氧化法形成二硫键是多肽合成中最经典的方法，通常是将巯基处于还原态的多肽溶于水中，在近中性或弱碱性条件下（PH值6.5-10），反应24小时以上。为了降低分子之间二硫键形成的可能，该方法通常需要在低浓度条件下进行。
 

碘氧化法：将多肽溶于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，逐滴滴加10-15mol/L的碘进行氧化，反应15-40min。当肽链中含有对碘比较敏感的Tyr、Trp、Met和His的残基时，氧化条件要控制的更精确，氧化完后，立即加入维生素C或硫代硫酸钠除去过量的碘。 当序列中有两对或多对二硫键需要成环时，通常有两种情况：
 

自然随机成环:       序列中的Cys之间随机成环，与一对二硫键成环条件相似；
 

定点成环：       定点成环即序列中的Cys按照设计要求形成二硫键，反应过程相对复杂。在 固相合成多肽之前，需要提前设计几对二硫键形成的顺序和方法路线，选择不同的侧链 巯基保护基，利用其性质差异，分步氧化形成两对或多对二硫键。       通常采用的巯基保护 基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多种基团。

靶向多肽可以根据其功能和用途分为不同的类别。在PDC（多肽偶联药物）中，靶向多肽通常被分为细胞穿透肽和细胞靶向肽两大类。

细胞穿透肽：这类多肽能够跨越细胞膜，转运具有生物活性的大分子物质，如多肽、蛋白质、核酸等化学药物，使其顺利进入细胞。一些常见的细胞穿透肽包括Pep-1、Pentratin、PepFact14、Transportan等。

细胞靶向肽：这类多肽的作用主要是引导化学药物或生物活性分子与特定类型的细胞结合，以提高其靶向性和治疗效率。常见的细胞靶向肽包括PEGA、生长激素抑制素类似物、蛙皮素类似物、RGD肽类等。