多肽荧光标记由于没有放射性,实验操作简单。因此,目前在生物学研究中多肽荧光标记应用非常广泛,多肽荧光标记方法与荧光试剂的结构有关系,对于有游离羧基的采用的方法与接多肽反应相同,也采用HBTU/HOBt/DIEA方法连接。 在N端标记FITC的多肽需经历环化作用来形成荧光素,通常会伴有最后一个氨基酸的去除,但当有一个间隔器如氨基己酸,或者是通过非酸性环境将目的多肽从树脂上切下来时,这种情况可避免在切割的过程中被TFA切割掉。
人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性,并将 其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发(例如,各种激 酶、磷酸酶、肽酶等)。
专肽生物能够提供技术成熟的各种荧光标记多肽。
下面是一些常见的多肽修饰荧光物质结构:
FITC标记
FITC(异硫氰酸荧光素)具有比较高的活性,我们公司可以通过两种方式将FITC标记于多肽 上:(1) 将FITC标记于赖氨酸(Lys)或被选择性地脱保护的鸟氨酸(ornithine)侧链氨基 上;(2) 将FITC标记于多肽N端氨基。
当在N端标记时,建议在最后一个氨基和由异硫氰酸酯与氨基反应产生的硫脲键之间引入 烷基间隔器(alkyl spacer),如氨基己酸(Ahx)。链接切割需要酸性环境,在N端标记FITC 的多肽需经历环化作用来形成荧光素,通常会伴有最后一个氨基酸的去除,但当有一个间隔器 如氨基己酸,或者是通过非酸性环境将目的肽从树脂上切下来时,这种情况可避免。空间位阻 被认为是在荧光染料前使用Ahx的主要原因,而不是为什么FITC不能直接偶联在多肽上的原因。
Ahx或b-Ala均可作为间隔器用于FITC标记的多肽上。
荧光修饰中文名称 | N端 | N端带有linker |
生物素标记多肽 | Biotin- | Biotin-Ahx- |
异硫氰酸荧光素 | FITC- | FITC-Ahx- |
5-羧基荧光素 | 5-FAM- | 5-FAM-Ahx- |
丹磺酰荧光素 | Dansyl- | Dansyl-Ahx- |
5-羧基四甲基罗丹明 | TMR- (TAMRA-) | TMR-Ahx- (TAMRA-Ahx-) |
多肽N端 | 多肽序列中间 | N端带有linker |
生物素标记多肽 | Biotin- | 多肽C端 |
Lys(Biotin)- | -Lys(Biotin)-- | -Lys(Biotin) |
Lys(FITC)- | -Lys(FITC)- | -Lys(FITC) |
Lys(5-FAM)- | -Lys(5-FAM)- | -Lys(5-FAM) |
Lys(Dansyl)- | -Lys(Dansyl)- | -Lys(Dansyl) |
Lys(TMR)- | -Lys(TMR)- | -Lys(TMR) |
Lys(Dnp)- | -Lys(Dnp)- | -Lys(Dnp) |
专肽常做的荧光物质的激发光波长和发射光波长。可供参考选择:
荧光基团 | Ex(nm) | Em(nm) | 荧光基团 | Ex(nm) | Em(nm) |
羟基香豆素 | 325 | 386 | R-phycoerythrin (PE) (489) | 565 | 578 |
丹磺酰氯 | 340 | 578 | Rhodamine Red-X | 560 | 580 |
AMC | 345 | 445 | Tamara | 565 | 580 |
甲氧基香豆素 | 360 | 410 | Alexa fluor 555 | 556 | 573 |
Alexa fluor 系列 | 345 | 442 | Alexa fluor 546 | 556 | 573 |
氨基香豆素 | 350 | 445 | Rox | 575 | 602 |
Dabcyl | 453 | - | Alexa fluor 568 | 578 | 603 |
Cy2 | 490 | 510 | Texas Red | 589 | 615 |
FAM | 495 | 517 | Alexa fluor 594 | 590 | 617 |
Alexa fluor 488 | 494 | 517 | Alexa fluor | 621 | 639 |
FITC | 495 | 519 | Alexa fluor 633 | 650 | 668 |
Alexa fluor 430 | 430 | 545 | Cy5 (625) | 650 | 670 |
5-FAM | 492 | 518 | Alexa fluor 660 | 663 | 690 |
Alexa fluor 532 | 530 | 530 | Cy5.5 | 675 | 694 |
HEX | 535 | 556 | TruRed | 490; 675 | 695 |
5-TAMRA | 542 | 568 | Alexa fluor 680 | 679 | 702 |
Cy3 | 550 | 570 | Cy7 | 743 | 767 |
TRITC | 547 | 572 | Cy3.5 | 581 | 596 |
ACTH的定义
促肾上腺皮质激素(ACTH、Adrenocorticotropic hormone)或促肾上腺皮质激素是垂体前叶产生的一种激素,它刺激肾上腺皮质。
促肾上腺皮质激素(ACTH),也称为促肾上腺皮质激素,是一种由垂体前叶腺产生和分泌的多肽促性激素。它是下丘脑-垂体-肾上腺轴的重要组成部分,通常是在对生物压力的反应中产生的(连同下丘脑的促肾上腺皮质激素释放激素)。它的主要作用是增加皮质类固醇的产生和释放,以及顾名思义,是肾上腺皮质的皮质醇。
ACTH是由前opiomelanocortin(pre-POMC)合成的。翻译过程中信号肽的去除产生了241个氨基酸的多肽POMC,在被内肽酶进行蛋白水解切割之前,它会经历一系列的翻译后修饰,例如磷酸化和糖基化,以产生具有不同生理活性的各种多肽片段。这些片段包括NPP,促黑素Gamma(γ-MSH),潜在肽,促肾上腺皮质激素(促肾上腺皮质激素或ACTH),促黑素Alpha(促黑素细胞激素或α-MSH),促肾上腺皮质激素样中间肽(CLIP),促肾上腺皮质激素Beta (β-LPH),脂蛋白Gamma(γ-LPH),促黑素β(β-MSH),β-内啡肽和Met-脑啡肽。POMC,
为了调节ACTH的分泌,该轴内分泌的许多物质表现出缓慢/中间和快速的反馈环活性。肾上腺皮质分泌的糖皮质激素起抑制下丘脑CRH分泌的作用,进而降低了ACTH的垂体前叶分泌。糖皮质激素也可能抑制POMC基因转录和肽合成的速率。后者是一个缓慢的反馈循环的例子,它的工作时间从几小时到几天不等,而前者的工作时间则在几分钟到几分钟。
ACTH还与许多生物体的昼夜节律有关。ACTH在人血中的半衰期约为十分钟。
相关肽
六个相关肽包括较小的生物活性片段(激素),这些片段是通过对前opiomelanocortin多蛋白(POMC)进行差分加工而从共同的前体衍生而来的。ACTH,促肾上腺皮质激素样中间叶蛋白[CLIP],β-内啡肽,γ-脂蛋白[yLPH],脑啡肽和α-黑素蛋白[aMSH] 1。
ACTH的发现
1930年代首次研究了ACTH的性质。1933年,由詹姆斯·科利普(James Collip),赫伯特·埃文斯(Herbert Evans)和贝玛尔多·侯赛(Bemardo Houssay)领导的研究小组使用垂体提取物刺激肾上腺皮质。美国生物化学家Choh Hao Li是1943年分离ACTH并在1963年对其进行合成的几位科学家之一。
ACTH的结构特征
ACTH的分子量为4541.3 K Da 2。它是由39个氨基组成的直链肽分子。前24个氨基酸和后7个氨基酸相同,而第25至32个氨基酸略有不同。只有前20个氨基酸才能发挥全部活性,称为活性中心。
ACTH的作用机制
ACTH进入全身循环并与位于肾上腺皮质细胞和皮肤表面的特定高亲和力受体结合。ACTH受体是七种跨膜的G蛋白偶联受体3,在配体结合后会经历构象变化,从而刺激腺苷酸环化酶,从而导致细胞内cAMP的增加和蛋白激酶A的激活。最终导致类固醇生成的刺激。
ACTH的功能
ACTH的主要功能是刺激肾上腺皮质分泌一组类固醇激素,称为糖皮质激素,盐皮质激素和雄激素类固醇。糖皮质激素可控制人体对糖的使用,并在压力时刻帮助调节生物功能。它刺激胆固醇转化为孕烯醇酮,这是所有类固醇激素的前体。它用于治疗类风湿关节炎,溃疡性结肠炎,肝炎和减轻疼痛。它们通过促进必需的蛋白质在特定于记忆的位点4合成所需的蛋白质,在记忆处理中起主要作用。
ACTH的的文献参考
1、Funkelstein L, Toneff T, Mosier C, Hwang SR, Beuschlein F, Lichtenauer UD, Reinheckel T, Peters C, Hook V (2008). Major role of cathepsin L for producing the peptide hormones ACTH, beta-endorphin, and alpha-MSH, illustrated by protease gene knockout and expression. J Biol Chem., 283(51):35652-35659.
2、Lee TH, Lerner AB, Buettner-Janusch V (1961). On the structure of human corticotropin (adrenocorticotropic hormone). J. Biol. Chem., 236:2970-2974.
3、Mountjoy KG, Robbins LS, Mortrud MT, Cone RD (1992). The cloning of a family of genes that encode the melanocortin receptors. Science, 257:248–1251.
4、Flood JF, Jarvik ME, Bennett EL, Orme AE (1976). Effects of ACTH peptide fragments on memory formation. Pharmacol Biochem Behav., 5:41-51.