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Ac-IEPD-AMC 是颗粒酶 B 的优选底物序列，颗粒酶 B 是哺乳动物丝氨酸蛋白酶，参与诱导细胞毒性淋巴细胞快速靶细胞死亡。

Ac-IEPD-AMC is a preferred substrate sequence of granzyme B, a mammalian serine protease involved in the induction of rapid target cell death by cytotoxic lymphocytes.

Ac-IEPD-AMC 是一种用于测定蛋白酶活性的荧光底物。Ac-IEPD-AMC 发生水解并释放荧光产物 7-氨基-4-甲基香豆素 (AMC)。AMC 在紫外光照射下呈荧光，可发出荧光信号。

研究人员比较了探针1与采用相同肽序列的可激活荧光探针的灵敏度。市售荧光底物Ac-IEPD-AMC含有7-氨基-4-甲基香豆素基团，该基团在被颗粒酶B切割后会在450纳米处发出荧光（图2a）。通过测量探针1与Ac-IEPD-AMC在活性颗粒酶B中反应30分钟后的信噪比（S/N），发现探针1的信噪比显著高于Ac-IEPD-AMC，且在10分钟内即可达到约100的信噪比值（图2b），而Ac-IEPD-AMC的信噪比始终低于5。最终研究测得探针1对颗粒酶B的检测限约为0.7纳摩尔，证实了这种化学发光结构的高灵敏度（补充图3）。值得注意的是，这些浓度值处于临床样本中报道的细胞外颗粒酶B动态范围内[44-46]，这突显了探针1在生物医学应用中的潜力。

参考文献

Scott JI, et, al. A Functional Chemiluminescent Probe for in Vivo Imaging of Natural Killer Cell Activity Against Tumours. Angew Chem Int Ed Engl. 2021 Mar 8;60(11):5699-5703.

AMC conjugated molecule targeting caspase-8 and granzyme B

Definition
Apoptosis or programmed cell death is a normal component of the development and health of multicellular organisms. Cells die in response to a variety of stimuli and during apoptosis they do so in a controlled, regulated fashion.

Discovery
In 1885,  Flemming W described the process of programmed cell death. John Kerr's discovery, in late 1960s, initially called "shrinkage necrosis" but which he later renamed "apoptosis", came about when his attention was caught by a curious form of liver cell death during his studies of acute liver injury in rats 1,2.  Kerr in 1972 proposed the term apoptosis is for mechanism of controlled cell deletion, which appears to play a complementary but opposite role to mitosis in the regulation of animal cell populations. Its morphological features suggest that it is an active, inherently programmed phenomenon, and it has been shown that it can be initiated or inhibited by a variety of environmental stimuli, both physiological and pathological 3. 

Structural Characteristics
Heterodimerization between members of the Bcl-2 family of proteins is a key event in the regulation of programmed cell death. The molecular basis for heterodimer formation was investigated by determination of the solution structure of a complex between the survival protein Bcl-xL and the death-promoting region of the Bcl-2-related protein Bak. The structure and binding affinities of mutant Bak peptides indicate that the Bak peptide adopts an amphipathic  helix that interacts with Bcl-xL through hydrophobic and electrostatic interactions. Mutations in full-length Bak that disrupt either type of interaction inhibit the ability of Bak to heterodimerize with Bcl-xL 4.

The structure of the 16–amino acid peptide complexed with a biologically active deletion mutant of Bcl-xL was determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR). The structure was determined from a total of 2813 NMR-derived restraints and is well defined by the NMR data. The Bak peptide forms a helix when complexed to Bcl-xL. The COOH terminal portion of the Bak peptide interacts predominantly with residues in the BH2 and BH3 regions. Melanoma inhibitor of apoptosis (ML-IAP) is a potent anti-apoptotic protein that is upregulated in a number of melanoma cell lines but not expressed in most normal adult tissues. Overexpression of IAP proteins, such as ML-IAP or the ubiquitously expressed X-chromosome-linked IAP (XIAP), in human cancers has been shown to suppress apoptosis induced by a variety of stimuli. X-ray crystal structures of ML-IAP-BIR in complex with Smac- and phage-derived peptides, together with peptide structure−activity-relationship data, indicate that the peptides can be modified to provide increased binding affinity and selectivity for ML-IAP-BIR relative to XIAP-BIR3 5.

Mode of Action
Upon receiving specific signals instructing the cells to undergo apoptosis a number of distinctive changes occur in the cell. Families of proteins known as caspases are typically activated in the early stages of apoptosis. These proteins breakdown or cleave key cellular components that are required for normal cellular function including structural proteins in the cytoskeleton and nuclear proteins such as DNA repair enzymes. The caspases can also activate other degradative enzymes such as DNases, which begin to cleave the DNA in the nucleus.

Apoptotic cells display distinctive morphology during the apoptotic process. Typically, the cell begins to shrink following the cleavage of lamins and actin filaments in the cytoskeleton. The breakdown of chromatin in the nucleus often leads to nuclear condensation and in many cases the nuclei of apoptotic cells take on a "horse-shoe" like appearance. Cells continue to shrink, packaging themselves into a form that allows for their removal by macrophages. There are a number of mechanisms through which apoptosis can be induced in cells. The sensitivity of cells to any of these stimuli can vary depending on a number of factors such as the expression of pro- and anti-apoptotic proteins (eg. the Bcl-2 proteins or the Inhibitor of Apoptosis Proteins), the severity of the stimulus and the stage of the cell cycle. The Bcl-2 family of proteins plays a central role in the regulation of apoptotic cell death induced by a wide variety of stimuli. Some proteins within this family, including Bcl-2 and Bcl-xL, inhibit programmed cell death, and others, such as Bax and Bak, can promote apoptosis 6, 7.

Functions

For development, Apoptosis is as needed for proper development as mitosis is.  Examples: The resorption of the tadpole tail at the time of its metamorphosis into a frog occurs by apoptosis.

Integrity of the organism, Apoptosis is needed to destroy cells that represent a threat to the integrity of the organism. Examples: Cells infected with viruses8.

Cells of the immune system, as cell-mediated immune responses wane, the effector cells must be removed to prevent them from attacking body constituents. CTLs induce apoptosis in each other and even in themselves 9.

Cells with DNA damage, damage to its genome can cause a cell to disrupt proper embryonic development leading to birth defects to become cancerous.

References

1.     Kerr JF (1965). A histochemical study of hypertrophy and ischaemic injury of rat liver with special reference to changes in lysosomes. Journal of Pathology and Bacteriology, 90(90):419-435.

2.     Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR (1972). Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer., 26(4):239-257.

3.     O'Rourke MG, Ellem KA (2000). John Kerr and apoptosis. Med. J. Aust., 173(11-12): 616-617.

4.     Franklin MC, Kadkhodayan S, Ackerly H, Alexandru D, Distefano MD, Elliott LO, Flygare JA, Mausisa G, Okawa DC, Ong D, Vucic D, Deshayes K, Fairbrother WJ (2003). Structure and function analysis of peptide antagonists of melanoma inhibitor of apoptosis (ML-IAP). Biochemistry, 42(27):8223-8231.

5.     Sattler M, Liang H, Nettesheim D, Meadows RP, Harlan JE, Eberstadt M, Yoon HS, Shuker SB, Chang BS, Minn AJ, Thompson CB, Fesik SW (1997). Structure of bcl-xl-bak peptide complex: recognition between regulators of apoptosis. Science, 275(5302):983-986.

6.     Hanada M, Aimé-Sempé C, Sato T, Reed JC (1995). Structure-function analysis of Bcl-2 protein. Identification of conserved domains important for homodimerization with Bcl-2 and heterodimerization with Bax. J. Biol. Chem., 270(20):11962-11969.

7.     Cheng EHY, Levine B, Boise LH, Thompson CB, Hardwic JM (1996). Bax-independent inhibition of apoptosis by Bcl-xL.Nature, 379:554-556.

8.     Alimonti JB, Ball TB, Fowke KR (2003). Mechanisms of CD4+ T lymphocyte cell death in human immunodeficiency virus infection and AIDS. J Gen Virology., 84(84): 1649-1661.

9.     Werlen G, Hausmann B, Naeher D, Palmer E (2003). Signaling life and death in the thymus: timing is everything. Science. 299(5614):1859-1863.

 Caspase酶对应的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶）是一类蛋白酶家族，其功能与凋亡（程序性细胞死亡），坏死和发烧（炎症）的过程密切相关。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它们是为细胞凋亡的主要介质。多种受体，例如TNF-α 受体，FasL受体，TLR和死亡受体，以及Bcl-2和凋亡抑制剂（IAP）蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦Caspase受到上游信号（外部或内在）刺激被激活，即会参与执行下游蛋白底物的水解作用，并触发一系列事件，导致细胞分解，死亡，吞噬作用和细胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为三大类：第一类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成，他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力。第二类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成，而第三类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分类：

       启动器Caspase和效应器Caspase酶

      根据其在凋亡胱天蛋白酶途径中的作用，胱天蛋白酶可分为两类：启动器和效应器Caspase酶。启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点，Caspase酶的识别位

      凋亡启动器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以启动caspase激活级联反应。Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效应子Caspase（例如Caspase 3）并介导线粒体中细胞色素c的释放。Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性。凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7虽然不负责启动级联途径，但是当被激活时，它们在级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是关键效应器，因为它放大了来自启动器Caspase的信号，使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测，可以检测Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制剂

      Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成：Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同，一般由三个或四个氨基酸组成（表2）。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基团修饰，以增强膜的通透性。对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点，释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的显色底物

      Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成，常见的生色团有pNA（对硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶标仪或分光光度计在405 nm处进行光密度检测。

       表3. Caspase的显色底物

       Caspase的荧光底物

      Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于两步裂解过程，其动态范围更窄。 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定，而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。

      图.从左到右，分别是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激发和发射光谱。

       表4.荧光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波长处的摩尔消光系数（单位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性缓冲液（pH 7.2）中的荧光量子产率。

       Caspase抑制剂

      Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接，通常，Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列，诸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的，而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用，因此，它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂

多肽AMC标记：定义、原理、应用及注意事项全解析

多肽AMC标记，全称多肽7-氨基-4-甲基香豆素标记（Peptide 7-Amino-4-Methylcoumarin Labeling），是一种将荧光分子“AMC”通过特异性共价键连接到多肽特定位点的修饰技术。其核心价值在于为多肽赋予可追踪、可定量的荧光特性，使其成为兼具生物活性与检测功能的“荧光探针”，广泛应用于生物医学科研、酶学分析及药物筛选等领域。

一、核心组件：AMC分子的核心特性

AMC（7-氨基-4-甲基香豆素）是该标记技术的核心荧光基团，其独特的化学与光学特性决定了标记效果，核心优势包括：

1. 光学性能稳定：激发波长约340-360 nm，发射波长约440-460 nm，荧光量子产率高，光漂白抗性强，且背景荧光低，能有效提升检测灵敏度；

2. 反应活性适配：AMC常以“活性酯衍生物”形式（如AMC-NHS酯、AMC-COOH）存在，可与多肽分子末端（N端/C端）或侧链（如赖氨酸的ε-氨基、天冬氨酸/谷氨酸的羧基）发生酰胺化反应，形成稳定的共价键，且对多肽的空间结构破坏极小；

3. 水溶性适配：AMC分子兼具一定的亲水性与疏水性，标记后不会显著改变多肽的溶解特性，适配后续水性体系的生物实验。

二、标记原理与核心流程

多肽AMC标记的核心是“特异性共价偶联”，需在温和条件下进行以保障多肽生物活性，典型流程如下：

1. 多肽预处理：先通过高效液相色谱（HPLC）等技术纯化目标多肽，去除杂质；同时确认多肽的活性位点（如受体结合位点、酶切位点），避开这些位点选择标记位点（常用N端氨基或C端羧基）；

2. AMC活性酯制备：将AMC与活化试剂（如NHS、DCC）反应，生成高活性的AMC-NHS酯（减少AMC自身聚合，提升与多肽的反应效率）；

3. 偶联反应：在缓冲体系（如PBS缓冲液，pH 7.0-8.0）中混合多肽与AMC活性酯，控制反应温度（25℃或4℃）与时间（2-4小时），让AMC活性酯的活性基团与多肽的氨基/羧基发生酰胺化反应，形成稳定的标记产物；

4. 纯化与验证：通过HPLC分离未反应的游离AMC、活化试剂及副产物，收集高纯度的AMC标记多肽；再通过质谱（确认分子量是否符合标记后理论值）、荧光光谱（验证荧光信号强度）进行质控，确保标记成功且多肽活性未受影响。

三、核心应用场景

AMC标记的核心优势的是“标记后多肽保留生物活性，荧光信号可实时定量检测”，因此主要应用于以下场景：

1. 蛋白酶活性检测（最核心应用）：将AMC标记在多肽底物的蛋白酶特异性识别序列末端，当蛋白酶切割多肽时，AMC基团被释放（游离AMC的荧光强度远高于结合态），通过检测荧光强度的变化速率，可定量分析蛋白酶的活性（如基质金属蛋白酶MMPs、胰蛋白酶、 caspases等的活性检测）；

2. 受体-配体结合分析：用AMC标记多肽配体，与细胞表面或纯化的受体孵育后，通过荧光成像可追踪配体与受体的结合过程，通过荧光强度定量结合亲和力（Kd值）；

3. 药物筛选：针对特定蛋白酶或受体的药物候选分子，以AMC标记多肽为探针，通过荧光信号的变化（如酶活性被抑制时荧光释放减少），高通量筛选药物的抑制/激活活性，评估药物 potency；

4. 多肽体内/体外追踪：AMC标记的多肽进入细胞或生物体内后，可通过荧光显微镜、小动物活体成像系统等设备，实时观察多肽的分布、转运及代谢过程，为多肽药物的药代动力学研究提供支撑。

四、关键注意事项

1. 标记位点选择：必须避开多肽的生物活性中心（如酶切位点、受体结合位点），否则会导致多肽失去原有功能；若多肽含多个氨基/羧基，可通过控制反应摩尔比、pH值实现特异性单点标记；

2. 反应条件控制：缓冲液pH需严格控制在7.0-8.0（过酸会抑制酰胺化反应，过碱会导致AMC活性酯水解失效）；低温反应（4℃）可减少多肽降解，适合不稳定多肽的标记；

3. 杂质去除：游离AMC会导致背景荧光偏高，影响检测准确性，因此标记后需通过HPLC彻底纯化，确保标记多肽纯度≥95%（科研级）或≥98%（药物研发级）；

4. 多肽稳定性保护：若多肽含半胱氨酸（Cys），需在反应体系中添加少量还原剂（如DTT），避免Cys侧链巯基氧化形成二硫键，影响多肽结构与标记效率；

5. 荧光检测条件匹配：检测时需根据AMC的光学特性调整激发/发射波长，避免与实验体系中其他荧光物质（如细胞自身荧光、染料）的光谱重叠，减少干扰。

五、AMC与AFC标记的核心区别（补充说明）

此前你关注过多肽AFC标记，两者核心差异在于荧光基团的结构与性能，具体对比如下：AMC含“甲基（-CH₃）”，AFC含“三氟甲基（-CF₃）”；AFC的背景荧光更低、光稳定性更强，但合成成本更高；AMC性价比更高，荧光信号强度足够满足多数科研需求，是更常用的基础荧光标记基团。

定义
细胞凋亡或程序性细胞死亡是多细胞生物发育和健康的正常组成部分。细胞响应各种刺激而死亡，在细胞凋亡期间，它们以受控，受控的方式死亡。

发现
1885年， Flemming W描述了程序性细胞死亡的过程。约翰·克尔（John Kerr）在1960年代后期的发现最初被称为“收缩坏死”，但后来改名为“细胞凋亡”，是在他对大鼠急性肝损伤的研究中，他的注意力被好奇的肝细胞死亡形式引起的 ^1,2。  1972年，Kerr提出了术语“细胞凋亡”的意思是控制细胞缺失的机制，它似乎在调节动物细胞群中与有丝分裂起着互补但相反的作用。它的形态学特征表明它是一种活跃的，固有编程的现象，并且已经表明它可以被多种环境刺激所引发或抑制， ³。 

结构特征
Bcl-2家族成员之间的异二聚化是调节程序性细胞死亡的关键事件。通过确定存活蛋白Bcl-xL和Bcl-2相关蛋白Bak的促死亡区域之间的复合物的溶液结构，研究了异二聚体形成的分子基础。突变型Bak肽的结构和结合亲和力表明Bak肽采用两亲性螺旋，通过疏水和静电相互作用与Bcl-xL相互作用。全长Bak的突变会破坏任一类型的相互作用，从而抑制Bak与Bcl-xL ⁴异源二聚的能力。

通过核磁共振波谱（NMR）确定与Bcl-xL具有生物活性的缺失突变体复合的16-氨基酸肽的结构。由总共2813个NMR约束确定结构，并通过NMR数据很好地定义了结构。当与Bcl-xL复合时，Bak肽形成螺旋。Bak肽的COOH末端部分主要与BH2和BH3区的残基相互作用。黑色素瘤细胞凋亡抑制剂（ML-IAP）是一种有效的抗凋亡蛋白，在许多黑色素瘤细胞系中上调，但在大多数正常成人组织中均未表达。在人类癌症中，IAP蛋白（例如ML-IAP或普遍表达的X染色体连接的IAP（XIAP））的过表达已显示可抑制多种刺激诱导的细胞凋亡。⁵。

作用方式
一旦收到指示细胞进行凋亡的特定信号，细胞中就会发生许多明显的变化。称为胱天蛋白酶的蛋白质家族通常在凋亡的早期被激活。这些蛋白质分解或切割正常细胞功能所需的关键细胞成分，包括细胞骨架中的结构蛋白和核蛋白（例如DNA修复酶）。半胱天冬酶还可以活化其他降解酶，例如DNase，其开始切割细胞核中的DNA。

凋亡细胞在凋亡过程中表现出独特的形态。通常，在细胞骨架中的lamins和肌动蛋白丝分裂后，细胞开始收缩。染色质在细胞核中的分解通常会导致核浓缩，并且在许多情况下，凋亡细胞的细胞核呈“马蹄形”的外观。细胞继续收缩，将自身包装成可被巨噬细胞去除的形式。有许多机制可以通过诱导细胞凋亡。细胞对这些刺激中任何一种的敏感性可能会因多种因素而异，例如促凋亡和抗凋亡蛋白（例如Bcl-2蛋白或凋亡蛋白的抑制剂）的表达，刺激的严重程度和细胞周期的阶段。Bcl-2蛋白家族在调节多种刺激诱导的凋亡细胞死亡中起着核心作用。该家族中的某些蛋白质，包括Bcl-2和Bcl-xL，可以抑制程序性细胞死亡，而其他蛋白质，例如Bax和Bak，可以促进细胞凋亡 ^6、7。

功能

对于发育，细胞凋亡与有丝分裂一样是正常发育所必需的。例子：tail变尾时into的吸收被青蛙吸收。

生物体的完整性需要凋亡来破坏对生物体完整性构成威胁的细胞。例子：感染了病毒的细胞⁸。

免疫系统的细胞，一种细胞介导的免疫反应减弱，必须去除效应细胞以防止它们攻击机体成分。CTLs互相诱导凋亡，甚至自身诱导凋亡⁹。

具有DNA损伤，破坏其基因组的细胞会导致细胞破坏正常的胚胎发育，导致先天缺陷变成癌。

参考

1.     Kerr JF (1965). A histochemical study of hypertrophy and ischaemic injury of rat liver with special reference to changes in lysosomes. Journal of Pathology and Bacteriology, 90(90):419-435.

2.     Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR (1972). Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer., 26(4):239-257.

3.     O'Rourke MG, Ellem KA (2000). John Kerr and apoptosis. Med. J. Aust., 173(11-12): 616-617.

4.     Franklin MC, Kadkhodayan S, Ackerly H, Alexandru D, Distefano MD, Elliott LO, Flygare JA, Mausisa G, Okawa DC, Ong D, Vucic D, Deshayes K, Fairbrother WJ (2003). Structure and function analysis of peptide antagonists of melanoma inhibitor of apoptosis (ML-IAP). Biochemistry, 42(27):8223-8231.

5.     Sattler M, Liang H, Nettesheim D, Meadows RP, Harlan JE, Eberstadt M, Yoon HS, Shuker SB, Chang BS, Minn AJ, Thompson CB, Fesik SW (1997). Structure of bcl-xl-bak peptide complex: recognition between regulators of apoptosis. Science, 275(5302):983-986.

6.     Hanada M, Aimé-Sempé C, Sato T, Reed JC (1995). Structure-function analysis of Bcl-2 protein. Identification of conserved domains important for homodimerization with Bcl-2 and heterodimerization with Bax. J. Biol. Chem., 270(20):11962-11969.

7.     Cheng EHY, Levine B, Boise LH, Thompson CB, Hardwic JM (1996). Bax-independent inhibition of apoptosis by Bcl-xL.Nature, 379:554-556.

8.     Alimonti JB, Ball TB, Fowke KR (2003). Mechanisms of CD4+ T lymphocyte cell death in human immunodeficiency virus infection and AIDS. J Gen Virology., 84(84): 1649-1661.

9.     Werlen G, Hausmann B, Naeher D, Palmer E (2003). Signaling life and death in the thymus: timing is everything. Science. 299(5614):1859-1863.

多肽Ac-Ile-Glu-Pro-Asp-AMC的合成步骤：

1、合成CTC树脂：称取0.4g CTC Resin（如初始取代度约为0.61mmol/g）和0.29mmol Fmoc-Asp(OtBu)-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入0.73mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到  Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin。结构图如下：

2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Asp(OtBu)-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取0.73mmol Fmoc-Pro-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入1.46mmol DIPEA，0.7mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Pro-Asp(OtBu)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Pro-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Pro-Asp(OtBu)-CTC Resin

H2N-Glu(OtBu)-Pro-Asp(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Ile-Glu(OtBu)-Pro-Asp(OtBu)-CTC Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Ile-Glu(OtBu)-Pro-Asp(OtBu)-CTC Resin，结构如下：

5、乙酸酐反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入0.73mmol 乙酸酐到树脂中，再加入1.46mmol DIPEA、0.7mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到Ac-Ile-Glu(OtBu)-Pro-Asp(OtBu)-CTC Resin。 结构如下：

6、全保护切割：配置0.5%TFA/DCM溶液，溶液体积约为树脂体积的3倍。再次用DCM洗涤树脂2遍（去除残留DMF），后将配置好的溶液倒入到反应器中，反应30分钟。抽滤树脂，收集滤液（此时多肽已经从树脂上分离，存在于滤液中）。多肽序列为 Ac-Ile-Glu(OtBu)-Pro-Asp(OtBu)-CTC Resin。 在滤液中添加DIEPA，调PH至7-8。用饱和NaHCO3洗涤滤液，分离出DCM层溶液。可适当旋蒸DCM层溶液，减少有机溶剂。再次加入1或2倍体积的乙酸乙酯，用稀HCl溶液调PH至微酸性，将多肽从DCM层萃取到乙酸乙酯层。用饱和NaCl洗涤2次乙酸乙酯层。用无水硫酸镁吸收乙酸乙酯层的水分。通过减压旋蒸，直接将乙酸乙酯完全旋蒸掉，得到晶体状固体多肽，用于下一步C端反应。或通过减压旋蒸保留适量乙酸乙酯的溶液体积，加入冰乙醚析出 多肽，然后对多肽进行烘干操作即可用于下一步C端反应。Ac-Ile-Glu(OtBu)-Pro-Asp(OtBu)-COOH的结构图如下。

7、7-氨基-4-甲基香豆素反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入0.73mmol 7-氨基-4-甲基香豆素到树脂中，再加入1.46mmol DIPEA、0.7mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到 Ac-Ile-Glu(OtBu)-Pro-Asp(OtBu)-AMC。 结构如下：

8、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品Ac-Ile-Glu-Pro-Asp-AMC。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

9、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

10、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽

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